葡萄查耳酮合酶基因克隆及其进化分析

蔡建平　侯和胜

摘 要： 利用RT-PCR 技术从葡萄中克隆到两个查耳酮合酶（CHS）的cDNA 开放阅读框（ORF）序列，分别命名为VvCHS1 和VvCHS3。其中，VvCHS1 序列长1 182 bp，编码393个氨基酸；VvCHS3 序列长1 170 bp，编码389个氨基酸。对两个CHS 基因编码的氨基酸序列的分析表明，二者均具有CHS基因家族的保守结构域。多序列比对和系统发生分析结果表明，两个CHS基因与其他高等植物CHS基因具有较高的相似性，然而VvCHS1和VvCHS3在结构和功能上出现歧化。

关键词：葡萄遗传；查耳酮合酶；基因克隆；进化分析

中图分类号：Q943.2 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.01.002

查尔酮合酶（Chalcone synthase，CHS）是将苯丙烷类代谢途径引向类黄酮合成的第1个关键酶，它催化3分子的丙二酰辅酶A （Malonyl CoA） 与1分子的香豆酰CoA（Coumaryl CoA）生成4，5，7-三羟基黄烷酮（Narigenin chalcone）。类黄酮类物质是广泛存在于高等植物中的次生代谢物，包括黄酮、异黄酮、黄烷酮、查耳酮、花色素苷、原花色素[1-4]。研究表明，类黄酮作为植物体内一种重要的保护性物质，在植物中具有重要的生理功能，包括抵御病原菌侵害、参与豆科植物根瘤菌形成、吸引昆虫和动物、促进花粉管生长、防止紫外线伤害、促进色素形成，等等。在应用方面，类黄酮类物质具有软化血管、抗癌、清除体内自由基等生理功能，已经成为植物次生代谢物应用研究的热点[5-10]。CHS基因是一个较大的基因家族，属于聚酮化合物合酶（PKS）超家族的一个分支。为探讨CHS在葡萄次生代谢中的调节和代谢途径转换作用，本研究采用RT-PCR 的方法，克隆得到葡萄CHS基因开放阅读框，并对其系统发生进行分析，为加深理解葡萄CHS基因功能奠定基础并提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

葡萄材料为本实验室种植的栽培种葡萄（Vitis vinifera）；E.coli DH5α为本实验室保存原菌；克隆载体为pMD19-T simple vector、反转录试剂盒、胶回收试剂盒均购自上海Invitrogen公司； 试验中所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 引物设计与合成

根据其他物种中已报道的查耳酮合酶基因序列及葡萄基因组数据库信息，进行BLAST比较，获得2个VvCHS基因完整开放阅读框序列，分别命名为VvCHS1和VvCHS3。利用Primer Premier5.0软件设计引物，引物序列为：VvCHS1-F 5' TAGAAGCCAGTAAAGCAGG3'；VvCHS1-R5' TCACCCAAGAATGACTACG3'；VvCHS3-F 5' TACCACAAGCCTCATCCC 3'；VvCHS3-R 5' GCAATCTATTACACCATACCCT 3' ，由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.3 葡萄CHS基因cDNA全长的获得

葡萄叶片总RNA的提取采用改良的SDS方法进行操作，获得的RNA用1%琼脂糖凝胶电泳检测。然后用反转录酶合成cDNA，以反转录的cDNA为模板，用引物对VvCHS1、VvCHS3进行扩增。VvCHS1扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；最后，72 ℃延伸10 min。VvCHS3扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，47 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；最后，72 ℃延伸10 min。按试剂盒上的操作指导回收凝胶电泳后与预期目的片段大小一致的泳带，经电泳检测后连接克隆载体（pMD19-T simple vector）并转化感受态细胞（E.coli DH5α），通过蓝白斑筛选及菌液PCR鉴定阳性克隆后，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.4 生物信息学分析

使用ClustalX进行同源序列比对，输出结果使用Mega4.0 软件进行Neighbor-joining法Bootstrap进化树校验。

2 结果与分析

2.1 葡萄RNA的提取及CHS基因全长cDNA的获得

提取到的葡萄总RNA凝胶电泳结果见图1。从图1可以看出，提取的总RNA完整无降解，质量较高，可以满足后续试验的要求。

以葡萄叶片cDNA为模板，用设计的葡萄CHS特异性引物进行PCR扩增（图2），得到单一条带，且大小与预测的相符。将扩增得到的条带切胶回收后与pMD-19T连接，转化到E.coli DH5α感受态细胞中，分别进行菌液PCR检测和测序检测，检测结果证实克隆得到VvCHS1和VvCHS3的完整ORF序列，ORF序列大小分别为1 182 bp和1 170 bp。

2.2 植物CHS基因的系统发生及其进化分析

在NCBI database数据库中搜索得到CHS 家族中目前已报道的cDNA 全长核苷酸序列，推导出其编码的氨基酸序列共20 条。并整合为Fasta 格式。根据氨基酸序列做进化树分析（图3）。结果表明，20 个来源于不同植物的CHS聚类到3个大组中，第1组最大，包括14 个蛋白；第2组次之，包括4 个蛋白；第3组只有两个蛋白。其中，第1组的14 个蛋白又分为至少3个亚组：5 个葡萄VvCHS，除VvCHS3 外，其余4 个形成第1亚组；豇豆和豌豆形成第2亚组；番茄、矮牵牛、蓝莓和葡萄VvCHS3 形成第3亚组。本文报道的VvCHS1 和VvCHS3 分属不同的两个亚组，表明植物CHS 基因在植物的进化过程中发生了歧化，形成了该基因在构成和功能上的多样性。与VvCHS3 同组的番茄、蓝莓和矮牵牛都是富含花青素的植物，说明VvCHS3 与花青素合成密切相关。而VvCHS1 及其与其聚类在同一亚组的其他3个VvCHS与相思树和非洲菊亲缘关系更近，至于其催化形成的查尔酮主要转化形成哪种次生代谢物，这还需要进一步研究。

3 结 论

采用RT-PCR技术从葡萄中克隆得到两个查耳酮合酶（CHS）的cDNA开放阅读框（ORF）序列VvCHS1、VvCHS3。其中，VvCHS1序列长1 182 bp，编码393个氨基酸；VvCHS3序列长1 170 bp，编码389个氨基酸。系统发生分析结果表明，两个CHS基因编码的氨基酸分属于第一大组的不同亚组，在进化中产生了歧化，形成了植物CHS的多样性。本文对葡萄查耳酮合酶基因及其系统发生的分析，为进一步研究该基因的功能及其在葡萄适应性机制中的作用奠定了基础。

参考文献：

[1] Fowler Z L， Koffas M A G. Biosynthesis and biotechnological production of flavanones： Current state and perspectives[J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 2009， 83 （5）：799-808.

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3 结 论

采用RT-PCR技术从葡萄中克隆得到两个查耳酮合酶（CHS）的cDNA开放阅读框（ORF）序列VvCHS1、VvCHS3。其中，VvCHS1序列长1 182 bp，编码393个氨基酸；VvCHS3序列长1 170 bp，编码389个氨基酸。系统发生分析结果表明，两个CHS基因编码的氨基酸分属于第一大组的不同亚组，在进化中产生了歧化，形成了植物CHS的多样性。本文对葡萄查耳酮合酶基因及其系统发生的分析，为进一步研究该基因的功能及其在葡萄适应性机制中的作用奠定了基础。

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3 结 论

采用RT-PCR技术从葡萄中克隆得到两个查耳酮合酶（CHS）的cDNA开放阅读框（ORF）序列VvCHS1、VvCHS3。其中，VvCHS1序列长1 182 bp，编码393个氨基酸；VvCHS3序列长1 170 bp，编码389个氨基酸。系统发生分析结果表明，两个CHS基因编码的氨基酸分属于第一大组的不同亚组，在进化中产生了歧化，形成了植物CHS的多样性。本文对葡萄查耳酮合酶基因及其系统发生的分析，为进一步研究该基因的功能及其在葡萄适应性机制中的作用奠定了基础。

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