大肠杆菌感受态细胞制备及转化条件优化

代军

摘要：针对大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α，以pGM-T、pMD-18T为载体，在传统CaCl2方法的基础上，对制备及转化条件进行了改进和优化，结果表明，42 ℃热激的最佳时间为100 s，最适冷却时间为6～8 min。本研究将常规的50 mL离心管改成了1.5 mL EP管，有效降低了分装过程中可能产生的污染风险，简化了试验程序，提高了转化效率。

关键词：基因克隆;大肠杆菌;感受态细胞;转化条件;改进;氯化钙法

中图分类号： Q-331 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）04-0053-02

收稿日期：2014-11-13

基金项目：国家林业公益性行业科研专项（编号：200904064）。

作者简介：代 军（1965—），女，辽宁阜新人，副教授，研究方向为农业生物技术。E-mail：40048601@qq.com。

大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是分子生物学试验中一项重要的常规操作技术，可用于基因克隆、文库构建等研究[1]。携带目的基因的重组质粒能否导入受体细胞，进而得以复制、增殖、表达，感受态细胞质量及转化条件是关键因素[2]。目前，商业公司可为分子生物学试验提供各种感受态细胞，但存在价格昂贵、运输途中容易导致感受态细胞解冻等问题[3-4]。大部分实验室仍采用经典的氯化钙法自行制备感受态细胞[5-6]。大肠杆菌菌株DH5α是实验室常用的宿主菌，常被用于基因克隆、原核表达研究。氯化钙转化方法具有操作简单、重复性好、转化率高等优点，其原理是Ca2+破坏细胞膜上的脂质阵列，并与膜上多聚羟基丁酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物以利于外源DNA渗入[7-8]。不同菌株、不同实验室环境对于感受态细胞制备及转化条件影响不同，因此有必要针对特定菌株对其感受态细胞制备、转化条件进行优化。本研究探讨该菌株感受态细胞制备以及转化的最优条件，旨在为后续分子生物学研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌菌株 E.coli DH5α由笔者所在实验室-70 ℃保存。载体pGM-T、pMD-18T Vector 购于天根生化科技（北京）有限公司、大连宝生物公司。0.1 mol/L CaCl2溶液所用无水CaCl2为国产分析纯。氨苄青霉素（ampicillin）购于天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 仪器

HITACHI SCR20BA 高速冷冻离心机，HH-6数显恒温水浴锅，MP 200A分析天平，Eppendorf移液器，超净工作台。

1.3 方法

1.3.1 准备工作 EP管、枪头、枪头盒、100 mL三角瓶、培养皿等进行高压蒸汽灭菌，100 ℃烘干，-20 ℃冷冻备用。

1.3.2 药品配制 0.1 mol/L CaCl2溶液：取1.11 g无水CaCl2，用容量瓶定容至100 mL，分装置于50 mL三角瓶中，高压蒸汽灭菌，4 ℃保存备用。100 mg/mL氨苄青霉素（Amp）：取 1 g Amp溶于100 mL无菌水中，分装至2 mL EP管中，滤膜过滤，-20 ℃保存备用。LB培养基：胰化蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0 g，琼脂粉14.0 g，溶于950 mL无菌水中，用5 mol/L NaOH调节pH值至7.0，定容至1 L，高压蒸汽灭菌，分装至培养皿。

1.3.3 菌种活化 将DH5α菌种在 LB 固体培养基平板上交错划线，37 ℃ 过夜培养，获得良好单斑。取无菌试管加入2 mL LB（不含抗生素）培养基，挑取良好单斑接种于试管中，37 ℃ 摇床培养过夜。按1 ∶ 100的比例，取 0.5 mL 菌液转接至含有 50 mL LB 液体培养基的三角烧瓶中，37 ℃ 摇床培养 2～3 h，直至 D600 nm 值达 0.4左右[9]。

1.3.4 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 将菌液分装至预冷无菌的1.5 mL EP管中，于冰上放置10 min，4 ℃ 4 000 r/min 离心10 min。将离心管倒置以倒尽上清液，用移液枪将倒不尽的上清液吸出，加入1 mL 0.1 mol/L冰冷CaCl2 溶液，立即在漩涡混合器上混匀，冰上放置30 min。4 ℃ 4 000 r/min 离心10 min，弃上清液，倒置1 min，加入1 mL 01 mol/L 冰冷CaCl2 溶液，移液枪轻轻吹打垂悬细胞，冰上放置30 min。4 ℃ 4 000 r/min离心10 min，弃上清液，倒置 1 min，每管中加入60 μL冰冷0.1 mol/L CaCl2 垂悬细胞，冰上放置 2 h，即可用于转化;也可加入体积分数为40%的甘油，-70 ℃超低温保存备用[10]。

1.3.5 质粒转化 将5 μL质粒DNA直接加入100 mL感受态细胞中，手指轻弹管底部混匀，冰浴30 min。42 ℃水浴热激，设置20 、30、40、60 、80 、90 、100 、120 s 8个时间梯度，设置2、4、6 、8 min 4个冰浴冷却时间。加入900 μL LB液体培养基（不含抗生素），37 ℃ 180 r/min振荡培养1.0～1.5 h。取上述转化混合液100 μL，滴到固体LB平板培养皿（含抗生素100 μg/mL Amp）中，用玻璃涂布棒涂布均匀。正面向上放置30～60 min，待表面菌液完全被培养基吸收，倒置培养皿，37 ℃过夜培养12～16 h[11]。

2 结果与分析

2.1 不同热激时间对转化效率的影响

菌种活化时，每隔30 min测1次D600 nm值（表1）。

表1 大肠杆菌DH5α活化后的D600 nm值