红花低分子量油体蛋白基因的克隆与系统进化分析

候文静　王旺　方锐　沃思宇　张捷　丁亦男

摘 要 目的：克隆红花低分子量油体蛋白基因L-Oleosin，并进行测序和序列比较分析。方法：参考已完成的红花转录组测序结果，设计特异性引物，从野生型红花种子中提取RNA，以 RT-PCR方法扩增L-Oleosin全长基因，测序之后，进行不同物种同源基因间的系统发生分析，应用Phylip软件绘制分子进化树。 结果：克隆了红花低分子量油体蛋白基因，系统发生分析表明，L-Oleosin基因的变异很大，物种间差异明显。 结论 进行油体蛋白基因相关功能研究和建立油体蛋白表达系统等方面的研究应该以同种属植物或亲缘关系较近的植物之间应用为主，基因工程改造和功能验证应在本物种上进行，然后拓展至近缘物种。

关键词 红花油体蛋白；基因克隆；系统发生分析

中图分类号：R284.2；R285 文献标志码：A 文章编号：1673-890X（2015）03-00-02

红花（Carthamus tinctorius L.）为菊科红花属的植物，含油率高、产量也高，因此成为新兴的油料作物，其含亚油酸高达70%～80%[1]。红花种子油在医药上常用作抗氧化剂和维生素A和D的稳定剂[2]。用红花油体系统作为生物反应器生产药用蛋白具有生产成本低、易于分离纯化、提高农业生产附加值等优点[3]。

Oleosin是与油体特异性结合的一种碱性蛋白质，也是油体中发现最早且含量最高的蛋白质，只存在于植物中[4]。Oleosin在被子植物主要存在高分子量和低分子量两种同型体[5]，为了探索油体蛋白与红花含油量的关系，便于利用基因工程改造提高红花的含油量，以及利用油体表达系统表达外源蛋白，本研究通过提取野生红花种子总RNA，反转录成cDNA之后，设计特异引物克隆了红花低分子量（L-Oleosin）油体蛋白基因，测序之后，进行了系统发生分析，为后续研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 种子与植株

野生红花种子，来源于新疆塔城，本实验室保存。

1.2 试剂

RNA提取试剂盒，RT-PCR试剂盒，T载体试剂盒，T4 DNA连接酶，核酸内切酶等为大连宝生物公司产品；其他试剂均为国产分析纯产品。

1.3 红花种子总RNA提取

取野生型红花种子置于液氮中，利用RNAiso Plus（大连宝生物工程有限公司）提取红花种子RNA，按照反转录试剂盒操作说明将其反转录成cDNA，作为PCR模板，应用自行设计的Oleosin基因特异性引物建立反应条件进行目的基因克隆，提取的RNA-80冰箱保存备用。

1.4 红花L-Oleosin基因PCR扩增的引物设计

引物序列设计参考课题组红花种子转录组测序结果的参考序列设计如下：

Fol上游 5- CCCTTCAAATCCATCGCACCTTCTTCC -3

Rol下游 5- AACGGAGCCTTTATTCACATTCATTAT -3

参照RT-PCR试剂盒说明书，将提取的红花种子总RNA反转录为cDNA。经优化后的PCR扩增程序为：94℃，40 s，55℃，40 s，72℃ 50 s，共30个循环，最后72℃再延伸6 min。

1.5 红花L-Oleosin基因测序与系统发生分析 PCR扩增的目的基因产物回收并纯化之后，克隆入pMD18-T载体中。酶切鉴定阳性的克隆委托上海英骏测序公司（Invitrogen）进行测序。

获得测序结果之后，检索NCBI数据库已公开资料，以BLAST检索比对L-Oleosin基因在不同物种间的全长编码序列，下载处理之后，利用phylip软件（3.695）采取邻接分析的最大似然距离（Maximum Likelihood，ML）法建立系统进化树，进而分析红花L-Oleosin基因的系统进化关系。

2 结果与分析

2.1 红花L-Oleosin基因的PCR扩增与测序

以红花种子总RNA反转录的cDNA为模板，进行 PCR扩增，扩增片段大小约750 bp。测序报告结果表明，成功克隆了红花L-Oleosin基因的全长编码序列，基因编码序列长度为488 bp，编码161个氨基酸。其蛋白一级结构序列中含有的不同植物油体蛋白均具备的经典“脯氨酸结”一级结构序列，即PLLVIFSPVLVP，共12个氨基酸，位于红花L-Oleosin蛋白氨基酸的第66-77位。

2.2 Phylip软件绘制的系统发生分析进化树

在Phylip软件包中，依次做SEQBOOT、DNADIST、NEIGHBOR计算，生成的进化树结果见图1，其中Olesin488为本研究克隆的红花L-Oleosin基因的全长编码序列。

图1 L-Oleosin基因的系统发生进化树

3 讨论

试验结果表明，进行油体蛋白基因相关的功能研究和建立油体蛋白表达系统等研究应该以同种属植物或亲缘关系较近的植物之间互相应用为主，本研究发现，红花油体蛋白的系统发生与拟南芥等模式植物的亲缘关系较近，因此可以在拟南芥中对红花油体蛋白基因进行相关表达和机制探索。若对油体蛋白进行基因工程改造和功能验证应首先在本物种上进行，然后拓展至近缘物种。

参考文献

[1]杨玉霞，吴卫，郑有良.红花研究进展[J].四川农业大学学报，2004，32（4）： 365–369.

[2]扈晓佳，殷莎，袁婷婷，等.红花的化学成分及其药理活性研究进展[J].药学实践杂志，2013，31（3）： 161-168.

[3]赵钢，王安虎.红花的资源及药用价值[J].中国野生植物资源，2004，23（3）：24-25.

[4]仇键，谭晓风.植物种子油体及相关蛋白研究综述[J].中南林学院学报，2005，25（4）：96-100.

[5]TAISS，CHEN MC，PENG C-C，et al. Gene Family of Oleosin Isoforms and Their Structural Stabilization in Sesame Seed 0il Bodies[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2002，66（10）： 2146-2153.

（责任编辑：刘昀）