鹅PRL基因克隆及在繁殖相关组织中的表达规律

杨廷桂+段修军+董飚+孙国波+纪荣超+卞友庆

摘要：以浙东白鹅为研究对象，采用克隆、测序技术获得浙东白鹅PRL基因789 bp的cDNA序列，包括了690 bp的编码区，编码229个氨基酸。并与其他物种进行同源性比较，发现该基因序列与其他鹅PRL序列相比发生了A170G、T315C、C316A、C318T、T516C、G617A突变;其中A170G发生了氨基酸H→R的变化，C318T处发生了氨基酸 H→N 的变化，G617A发生了氨基酸R→H的变化。与禽类PRL基因核苷酸和氨基酸序列同源性均在92.9%以上，与人和哺乳动物同源性在51.8%～77.2%之间。利用实时荧光定量PCR技术检测鹅产蛋期到就巢期PRL基因在相关组织中的表达变化。在产蛋期和就巢期，垂体中PRL基因表达量显著高于其他3个组织，下丘脑、卵巢、输卵管3个组织之间PRL基因mRNA表达量没有显著性差异。就巢期组织中PRL基因表达量极显著高于产蛋期同一组织中 mRNA 表达量。

关键词：浙东白鹅;PRL基因;基因克隆;mRNA表达;繁殖;产蛋期;就巢期

中图分类号： S835.2 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）04-0024-03

收稿日期：2014-05-14

资助项目：江苏省泰州市科技项目。

作者简介：杨廷桂（1954—），男，江苏扬州人，教授，主要从事水禽育种与疾病防治研究。E-mail：tgy@126.com。

自然状态下，禽类产蛋到一定阶段就会产生就巢行为，这是禽类重要母性表征之一，也是禽类得以繁衍和进化的保证。在世界众多家禽品种中，大多数家禽仍然保持着或强或弱的就巢性。我国具有丰富的鹅遗传资源，部分地方品种就巢性均较强。我国一些地方鹅种体型大，就巢性强，一般1年中产蛋3～4次，每次产蛋8枚左右就开始就巢孵化。如浙江省的浙东白鹅、安徽省的皖西白鹅、湖南省的溆浦鹅、广东省的狮头鹅、江苏省的洪泽湖鹅等，这些鹅品种都是人类长期选育而得，是优良的地方品种。扩大这些品种的饲养量，是发挥其优良特性的有效手段，但是就巢性影响了其快速扩大的步伐。随着鹅蛋人工孵化技术成熟，不需要鹅进行就巢孵化。如何降低鹅的就巢行为、提高繁殖性能是广大研究者关注的问题之一。

禽类就巢性的遗传机理比较复杂，具体遗传机理还不清楚。目前普遍认为，就巢性是由环境、内分泌系统、基因型相互作用的结果。下丘脑-垂体-卵巢轴是一个完整而协调的神经内分泌系统，它的每个环节均有其独特的神经内分泌功能，并且相互调节、相互影响。它的主要生理功能是控制雌性动物的性功能，涉及到多种激素的作用，这些激素又是由基因控制的。催乳素（prolactin，PRL）是垂体前叶嗜酸细胞分泌的多肽类激素，对动物的繁殖和泌乳、新陈代谢等起着调节作用[1]。催乳素的早期研究是测定禽类不同繁殖时期血液中催乳素的含量，发现鸡、火鸡、鸭、鹅就巢性的发生和维持都受到PRL的调控，在就巢期间PRL水平明显上升，就巢结束时下降[2-3]。狮头鹅在就巢期血清中PRL浓度最高，远远高于其他繁殖阶段[4]。郭军等利用抑制消减杂交技术发现母鹅就巢时PRL基因表达上调，推断PRL基因是影响就巢性的关键基因[5]。汪峰等发现雪山草鸡种鸡垂体中PRL基因的表达与其繁殖性能呈显著负相关[6]。张学余等发现PRL基因调控区的插入/缺失（24 bp）能显著影响72周龄白耳鸡的产蛋数[7]。前人的研究均显示催乳素基因在禽类生殖周期中起着重要的作用。

本研究拟以浙东白鹅为材料，设计引物，克隆浙东白鹅PRL基因，并分析其与GenBank中登录的部分动物PRL基因的同源性;采集产蛋期和就巢期垂体、下丘脑、卵巢、输卵管组织，采用实时荧光定量PCR方法检测PRL在浙东白鹅繁殖过程中的表达规律，以进一步丰富鹅就巢性分子机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为产蛋和就巢期的浙东白鹅（在第2个产蛋期期间）。在2个时间段内随机选取5只母鹅。屠宰放血后，采集下丘脑、垂体、卵巢、输卵管组织置液氮速冻，-80 ℃冻存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 引物的设计 根据GenBank中公布的禽类PRL基因序列，用DNAMAN进行比较，寻找保守区设计引物，引物送上海桑尼生物技术有限公司进行合成。引物序列及信息见表1，其中引物A1用于PRL基因克隆，A2、A3分别用于实时荧光定量PCR时用于扩增PRL、β-actin基因。

表1 基因克隆和mRNA表达所用引物信息表

引物名称 引物序列（5′→3′） 作用

A1 F：CTTTCTGGCAGAGCAAGTC PRL基因克隆

R：TGGCAAAGCA ACAAGAACAC

A2 F：TGAAAGGTTTGTTGCTGGTGG 实时荧光定量PCR

R：GGGCAGATAGGCAAGGAGGT

A3 F：CCCATCTATGAGGGCTACGC β-actin

R：TGATGTCACGGACGATTTCC

1.2.2 RNA提取及反转录 采用Trizol法提取浙东白鹅组织中总RNA，利用核酸浓度测定仪检测RNA浓度和纯度。按照Takara逆转录试剂盒操作说明书进行cDNA合成，以适量RNA为模板，以Oligo（DT）为引物在逆转录酶的作用下合成cDNA。

1.3 PCR扩增

以cDNA为模板，用引物A1进行扩增获得PRL序列。PCR反应体系为25 μL：10×PCR 缓冲液 （无Mg2+）2.5 μL，dNTP （2.5 mmol/L） 2 μL，MgCl2 （25 mmol/L）1.5 μL，上、下游引物 （10 pmol/L）各 1 μL，rTaq 聚合酶 （5 U/μL，Takara Tokyo，Japan）0.2 μL，cDNA模板 1 μL，dH2O 15.8 μL。

1.4 克隆及测序

PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳分离后，切取目的条带，对PCR产物进行纯化回收。回收的PCR产物与pMD19-T载体连接。重组子转化感受态细胞DH5-α，涂在含氨苄青霉素的LB培养基上，37 ℃培养12 h。随机挑取菌落，用菌液PCR法和酶切法筛选阳性克隆，每个基因挑选2～3个阳性克隆送上海桑尼生物技术有限公司测序。

1.5 实时荧光定量PCR检测

严格按照LC-480荧光定量PCR仪说明书进行试验操作。用UltraSYBR Mixture（with Rox）进行扩增，程序为：95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40个循环。RealTime反应体系为：UltraSYBR Mixture 10 μL，上游引物（10 μmol/L） 0.4 μL，下游引物（10 μmol/L）0.4 μL，模板 2 μL，加入灭菌蒸馏水至20 μL。

1.6 序列分析与数据分析

基因序列用NCBI上的Blast进行序列比对（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.BLAST/），用DNAMAN 6.0生物软件进行序列的翻译和作图。实时荧光定量结果采用2-ΔΔCT法计算目的基因的相对表达量。SPSS 17.0统计分析软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 PRL基因克隆和序列分析

2.1.1 PRL基因PCR扩增结果 对浙东白鹅垂体、卵巢等组织提取的总RNA进行反转录合成cDNA，以A1为引物进行PCR扩增，扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳分离，结果见图1。由图1可知，PCR扩增产物长度为800 bp左右，与引物设计时参照其他物种推测的长度相符，初步断定其可能是PRL基因的序列。

2.1.2 序列分析结果 经克隆测序获得1个扩增片段的cDNA序列，序列长度为789 bp（图2）。进一步序列分析，发现这段序列包括690 bp的编码区，编码229个氨基酸。将这段核苷酸序列编码区与GenBank中的东北籽鹅（FJ527782）、皖西白鹅（DQ062571）、莱茵鹅（DQ066733）、马 岗 鹅（DQ345783）的序列进行比较，发现该PRL基因在编码区序列中存在6个点突变，分别为A170G、T315C、C316A、C318T、T516C、G617A;其中A170G发生了氨基酸H→R的变化，C318T处发生了氨基酸H→N的变化，G617A发生了氨基酸R→H的变化。

2.1.3 不同物种间序列同源性比较 表2是根据PRL基因编码区核苷酸、氨基酸序列采用软件DNAMAN分析不同物种间同源性结果。由表2可知，浙东白鹅编码区序列与野鸭（AB158610）、鸡（NM_205466）、人（NM_000948）、小鼠（NM_011164）、猪（NM_213926）、牛（NM_173953）等动物PRL基因序列核苷酸序列同源性为61.8%～98.8%，其中与野鸭同源性最高，与小鼠的同源性最低。进一步进行氨基酸序列比较可知，浙东白鹅与禽类中野鸭、鸡的同源性较高，均在93.9%以上，与哺乳动物猪的同源性也达到了77.2%，与小鼠的同源性仅有51.8%。

表2 浙江白鹅与不同动物PRL基因氨基酸及核苷酸序列的相似性

指标

相似性（%）

野鸭 鸡 人 小鼠 猪 牛

核苷酸序列 98.8 92.9 70.1 61.8 73.1 68.7

氨基酸序列 99.1 93.9 68.3 51.8 77.2 68.4

2.2 PRL基因在组织中表达

本试验采用Real-Time PCR方法检测了PRL基因在浙东白鹅垂体、下丘脑、卵巢、输卵管4个组织中产蛋期和就巢期2个时期表达规律（表3）。由表3可知，无论在产蛋期还是在就巢期，垂体中PRL基因mRNA表达量显著性高于其他3个组织，其他3个组织中之间PRL基因mRNA表达量没有显著性差异。与产蛋期相比，就巢期组织中PRL基因表达量极显著高于产蛋期的同一组织中mRNA表达量（图3）。

表3 浙东白鹅PRL基因在繁殖调控组织中的表达结果

组织 产蛋期表达量 就巢期表达量

垂体 9.19±0.98a 27.50±2.21a

下丘脑 1.36±0.21b 5.32±0.37b

卵巢 1.87±0.21b 5.68±0.46b

输卵管 0.83±0.06b 6.02±0.48b

注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

3 讨论

浙东白鹅是我国优良的肉用白鹅，其体型较大，广受养殖者和消费者的青睐，但是其产蛋量有限，年产蛋量在30枚左右，每次产蛋8枚左右就开始出现就巢现象，就巢时间约为产蛋期的2倍，同时就巢时卵巢和输卵管退化，严重影响了浙东白鹅的产蛋量，制约了产业的发展壮大。PRL通过下丘脑-垂体-卵巢轴引发禽类的就巢行为，是就巢行为发生和维持的重要基因之一。本研究首次从浙东白鹅卵巢组织中提取RNA，通过反转录、克隆、测序获得了浙东白鹅PRL基因的cDNA序列，包含了完成的编码区，共编码229个氨基酸。通过序列比较，发现浙东白鹅PRL在不同鹅品种中存在6个点突变，分别为A170G、T315C、C316A、C318T、T516C、G617A，其中第1、第4、第6处的点突变引起了氨基酸序列发生了变化，表明鹅 PRL序列存在单核苷酸多态性，这些碱基变异导致了氨基酸残基的差异，这是否是不同鹅品种就巢性和产蛋性能差异的原因，还需要进一步试验证实。

禽类的繁殖性能主要由卵泡发育数量和排卵频率决定的，受到性腺轴的调控，分为下丘脑的长调控、垂体的中调控和卵巢的短调控作用。催乳素（PRL）是产蛋期、就巢期的重要功能基因，通过抑制下丘脑分泌促性腺激素释放激素来实现对繁殖的抑制作用。下丘脑PRL表达的增加说明其通过反馈调节系统调节催乳素的自分泌或旁分泌机制，进一步增加催乳素表达。本试验采用Real-Time PCR方法检测了PRL基因在垂体、下丘脑、卵巢、输卵管4个组织中产蛋期和就巢期2个时期表达规律。在4个组织中，垂体中PRL基因的表达量一直处于最高位置，其他3个组织之间表达量没有显著性差异，这可能是由于垂体是催乳素的分泌器官。就巢期组织中PRL基因表达量极显著高于产蛋期的同一组织中表达量，说明从产蛋期进入就巢期鹅通过体内内源性PRL表达增加来维持就巢性状，这与张响英等在狮头鹅、魏茹华在皖西白鹅中的研究结果[4，8]一致，也与Kansaku在火鸡[9]和Lea等在鸡[10]上的试验结果相同。

禽类就巢性的发生是家禽的内分泌激素、遗传和环境等诸多因素共同作用的结果，其遗传力低，通过常规的选育方法难以完全剔除就巢性。本研究克隆了浙东白鹅PRL基因编码区序列，发现PRL基因在就巢期表达量显著增加，说明PRL基因在禽类就巢时的重要性;通过与其他鹅品种的序列比较，发现不同鹅品种序列之间存在点突变，本研究为开展PRL基因能否作为剔除就巢性的候选基因进行了有益探索。

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