高温胁迫下草坪草高羊茅差异表达基因的分子研究

李卉　王艳　王海宏　梁珂珂　李建龙

摘 要：通过构建高羊茅高温胁迫下的消减文库，并使用斑点印迹技术从中筛选出差异表达基因，以期深入研究高羊茅适应高温的分子机制。以冷季型草坪草高羊茅为研究对象，在两年生理指标测定的基础上通过构建高羊茅在高温胁迫下的SSH文库，分别以正、反向SSH探针与尼龙膜上的消减cDNA质粒进行杂交，并经相应的显色反应得到杂交信号，比较了38/30 °C（昼/夜）的培养箱中高温胁迫6 h的高羊茅叶片和对照组高羊茅叶片的RNA差异。结果表明：试验得到的差减文库中大量组成型表达基因已经被有效去除，使某些特有的差异基因得到了富集；利用斑点杂交共得到252个差异片段，库中阳性克隆约占50%以上；阳性克隆中91个为上调基因，161个为下调基因，这些与高羊茅的耐热性密切相关的基因即为试验所寻的差异表达基因。本试验为找出高羊茅耐热相关基因奠定了基础，为草坪草的转基因育种工作提供了相关依据，结合恰当的水肥调控措施可有效提高草坪草的抗逆性。

关键词：高温胁迫；逆境生理；差异表达基因；抑制差减杂交；斑点印迹技术；阳性克隆

中图分类号：S688.4 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.01.001

随着经济的高速发展和城市化水平的不断提高，人们的健康意识和审美意识不断提高，使得城市绿化越来越受到重视。草坪作为一种优良的绿化材料，种植面积迅速扩大。草坪草可分为暖季型草坪草和冷季型草坪草。其中，在寒冷条件下能正常生长发育的草坪草就是冷季型草坪草，常见于温带和副极带地区，如早熟禾（Poa Prateusis）、黑麦草（Lolium perenne）、剪股颖（Agrostis tenui）和羊茅（Festuca avina）等。其生长的最适温度为15～24 ℃，高于30 ℃一般会出现夏季枯黄和死亡现象。冷季型草坪草的绿期相对较长，但随着全球气温的升高以及城市热岛效应的日益凸显，越夏就成了冷季型优良草坪草品种亟需解决的问题。如何提高冷季型草坪草的抗热性显得尤为重要，因此，研究草坪草的高温胁迫机理特别是其生理机制和分子机制对于鉴定和选育耐热的冷季型草坪草具有重要的理论和实践意义。当植物受到低温或者高温胁迫时，正常的生理过程受到干扰，细胞代谢紊乱，生长被抑制。但是植物也可以通过应激反应延缓或者阻止伤害的发生，这就为人们通过各种管理和调控措施改善草坪草的抗热性和抗寒性提供了可能性。对于逆境生理和抗性调控机理的研究可以更详细地了解草坪草的生理特性，为草坪草的建植、养护和管理，以及新品种的选育提供坚实的理论基础。

冷季型草坪草抗热性有相关研究主要从生理生态学角度对比热敏感和耐热植株在高温胁迫下的形态和生理指标，以及植株在热胁迫前后的生理生态变化，通过一些物理、化学等手段，改善草坪草的耐热性，例如管理措施（覆盖、浇水、修剪等）、抗性锻炼、施肥、施用生长调节剂和育种等。然而基因才是真正调控植物对环境响应方式的物质，因此，草坪草耐热性相关基因必然成为深入研究草坪草耐热性的关键和热点。目前，分离并克隆草坪草抗逆基因的研究已有部分报道。李广存等[1]对草坪草狗牙根中抗逆基因BeDREB进行了克隆及功能鉴定；Li等[2]利用抑制差减杂交的方法研究了耐高温剪股颖的高温胁迫响应基因；George 等[3]和Velculescu等[4]在热胁迫下对比了剪股颖耐热与不耐热品种根、茎中的基因差异表达，鉴定和描述了苹果菌素基因AsEXP1与剪股颖耐热性的关系。

抑制消减杂交（Suppression subtractive hybridization，SSH）技术己成功地从植物中克隆了很多重要基因[5]。SSH的主要缺点就是产生假阳性，因为在消减过程中，只有一个过程可富集目的基因，因此不可避免地会增加背景序列。而将斑点印迹技术应用于抑制消减杂交差别表达基因克隆的初筛，一方面可以鉴定文库质量，另一方面它可以进一步剔除文库中的假阳性克隆，真正获得目的优势表达的基因。高羊茅（Festuca arundinacea）作为耐热性相对较好的冷季型草坪草，近年来在亚热带地区得到广泛应用。本试验以冷季型草坪草高羊茅为研究对象，在两年生理生态指标测定的基础上进一步做了分子水平的研究，进行了高温胁迫下草坪草高羊茅抑制差减杂交文库的构建和差异表达基因的斑点杂交，通过信号扫描获得阳性克隆，为后续的序列特征和功能预测试验提供依据，同时为草坪草引入编码代谢途径的大片段DNA的转基因育种工作提供相关依据，结合恰当的水肥调控措施有效提高草坪草的抗热性等逆境承受能力。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验品种 试验所选品种为凌志高羊茅（Festuca arundinacea cv. Barlexas），种子购自北京克劳沃种子公司。选择健康的草坪草种子播种在装有混合培养基质（沙子/蛭石/有机营养土 = 3/1/1）的聚乙烯花盆中。聚乙烯花盆直径为13 cm，深14 cm，每盆播种175～180粒种子。所有盆钵在室外自然光照下进行培养，气温为15～26 °C。盆钵内的草坪草每天用自来水浇灌至盆钵底有水从小孔渗出，每周用Hoagland营养液[6]浇灌一次。20 d后将所有盆钵再转移到人工气候箱（型号：LRH-300-CS，广东省医疗器械厂生产）培养14 d，管理方式同上，人工气候箱被设置为14 h的光周期，光照强度为400 μmol·m-2·s-1， 相对湿度为（65 ±10）%， 温度为26 °C /15 °C （昼/夜，对照温度）。盆钵在人工气候箱内随机摆放并定期交换以保证每盆所受内部环境影响一致。

一半草坪草转入38/30 °C（昼/夜）的培养箱中进行高温胁迫（处理植株），光照、相对湿度以及管理方式均与对照温度下光照培养箱中的一致。另一半仍旧在原条件下培养作为对照植株。在胁迫第6 h时取处理和对照的高羊茅叶片分别提取总RNA进行试验。

1.1.2 试剂 RNAiso-mate for Plant Tissue，D325S，TaKaRa；RNAisoTM Plus，D9108B，TaKaRa； PCR-Select cDNA Subtraction Kit，637401，Clontech；Super SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit，635000，Clontech；QIAquick PCR Purification Kit，28104，Qiagen；Advantage 2 Polymerase Mix，639201，Clontech；DL2000，条带依次为2 000，1 000， 750，500，250，100（Marker），D501A，TaKaRa。

1.2 试验仪器

PCR仪，ABI 9700型PCR扩增仪；离心机，5418型，eppendorf；凝胶成像系统，Tanon 2500，天能公司；紫外分光光度计，GeneQuant II，Pharmacia Biotech。

1.3 试验方法

1.3.1 高羊茅总RNA提取与mRNA的分离、纯化 取50～100 mg组织于液氮中研磨，加入1 mL缓冲液提取组织总RNA。将总RNA溶于DEPC-H2O，用Dnase I 37 ℃处理30 min，抽提纯化RNA。用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳对总RNA的浓度及纯度进行检测。

1.3.2 高羊茅SSH文库的构建 将提取出的RNA反转录合成cDNA，然后对cDNA进行纯化以及cDNA RsaI酶切，将双链cDNA消化成短的平端cDNA片段，便于下一步的差减和接头连接，具体可参考PCR-Select cDNA Subtraction Kit说明书。接头连接和差减杂交，进行两轮差减杂交，并且对两轮差减杂交结果进行差减PCR。纯化PCR产物，提取4 mL，并用TaKaRa公司的PMDl9-T Vector连接消减杂交片段。用氯化钙二次重悬法制备感受态大肠杆菌。取出储存于-80 ℃的大肠杆菌菌株的保存菌液，37 ℃下，转速为225 r·min-1，扩大培养约至2.5～3.0 h，OD600=0.4时结束。将0.1 mol·L-1CaCl2溶液冰水浴冷却，提取2 mL并轻轻震荡菌体至均匀，冰水浴30 min后，得到感受态细胞悬液；加入5 mL连接产物，在恒温振荡器上复苏培养80 min，让受体菌恢复正常生长； 37 ℃在LB固体培养基平板上均匀涂布Amp（50 μg·mL-1）、x-gal（80 μg·mL-1）和IPTG（0.5 mmol·L-1），倒置培养于恒温培养箱中14～16 h，直至长出大小合适的蓝、白菌落。取白色饱满菌落置于96细胞培养板，于37 ℃下静置培养16～20 h，加入13 μL甘油（甘油经过高压蒸汽灭菌）混匀，-70 ℃保存，即可建成SSH文库。

1.3.3 斑点杂交 根据下列方阵点膜，每个点各取0.6 μLPCR产物（插入片断鉴定PCR产物）。

2 结果与分析

SSH和基因芯片技术的相结合是从阳性克隆中筛选差异基因比较理想的方法，它在一次杂交中就可对成千上万的基因进行检测，但是首先要有预先制备好的基因表达谱芯片。制备一张较完备的基因芯片经费要求较高，需要对研究对象的遗传背景有较好的了解。另外，运用基因芯片研究基因表达时，低丰度的基因往往难以检测出来。因此，对于一些遗传背景不清晰的物种来说，利用传统意义上的基因芯片技术研究其在不同代谢或生理状态的基因表达谱的变化是困难而且不经济的。因此，将斑点印迹技术应用于抑制消减杂交差别表达基因克隆的初筛，一方面可以鉴定文库质量，更重要的是可以进一步剔除文库中的假阳性克隆，真正获得目的优势表达的基因。本试验即在应用SSH技术建立高羊茅耐热基因抑制消减文库，然后使用斑点印迹技术对差别表达基因克隆进行初步筛选，获得阳性克隆。

根据阳性克隆信号强弱的数据，变化倍数取log2，然后进行升序排列的结果，得到上调和下调结果。上调的基因为91个；下调基因为22个，这两部分数据与草坪草抗热性的获得显著相关，是研究所关注的基因组，将进一步对其进行测序和分析。其余还有下调基因145个，这部分基因与抗热性的获得相关，但不是关键基因，这部分数据可以作为选测数据，以便对抗热相关基因进行测序和生物信息学分析。

3 讨 论

在本研究中，为了从已构建好的消减文库中筛选差异表达基因，分别以正向和反向SSH探针与尼龙膜上的消减cDNA质粒进行杂交，消减cDNA质粒与具有同源序列的探针结合，经洗涤去除未结合的质粒，经相应的显色反应显出杂交信号。通过杂交信号的强度差异筛选出阳性克隆。

当植物受到高温胁迫时，正常的生理过程受到干扰，细胞代谢紊乱。同时，植物也可以通过应激反应延缓或者阻止伤害的发生。有关逆境生理和抗性调控机理已经进行了大量的研究[7-10]，试验表明：在植物受到胁迫时，体内的各种生化指标都会发生变化，甚至产生一些新的蛋白，如热激蛋白，保护植物免受或延缓伤害[11]。现有研究已经知道植物对环境产生的大多数生理响应都得通过改变基因表达来实现。进一步的研究发现在中等胁迫或者外源物质的刺激下，各种保护机制也会快速反应[12]，从而减轻了进一步的胁迫对植物体造成的伤害。可见，抗逆基因的响应远远早于生理指标的变化。

植株对逆境的响应是一个复杂的系统过程，所表达的差异基因涉及到生理代谢的各个方面[13]。传统的研究受到研究手段和方法的限制，往往只能从一个方面去认识逆境下的生理或者基因的变化规律，而不能全面地揭示逆境引起的基因组变化[14]。现代基因组学为系统研究逆境差异基因提供了条件，避免了研究的盲目性。在本试验中共获得252个差异基因，通过进一步的生物信息学分析可以知道他们的功能、涉及的代谢系统，以及与抗热性的相关性，从而为后续的基因克隆、调控提供试验支持。

4 结 论

（1）本试验从正向和反向文库中分别随机挑选了384个克隆，利用斑点杂交共得到252个差异片段，库中阳性克隆约占50%以上。

（2）阳性克隆中，91个为上调基因，161个为下调基因。这些基因即为试验所要寻找的差异表达基因，他们与高羊茅的耐热性比密切相关。

（3）本试验为草坪草耐热基因的研究提供了基础，可进行后续的测序和功能鉴定工作，同时也为草坪草转基因育种提供了相关依据，结合恰当的水肥调控，可有效提高草坪草的逆境耐受力，从而延长青绿期，提高生态价值。

参考文献：

[1] 李广存，金黎平，谢开云，等. 抑制差减杂交（SSH）技术及其在植物基因分离上的应用[J].中国生物工程杂志， 2004， 24（9）： 26-32.

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[14] 李建龙.草坪草抗性生理生态研究进展[M]. 南京：南京大学出版社，2008：24-25.

4 结 论

（1）本试验从正向和反向文库中分别随机挑选了384个克隆，利用斑点杂交共得到252个差异片段，库中阳性克隆约占50%以上。

（2）阳性克隆中，91个为上调基因，161个为下调基因。这些基因即为试验所要寻找的差异表达基因，他们与高羊茅的耐热性比密切相关。

（3）本试验为草坪草耐热基因的研究提供了基础，可进行后续的测序和功能鉴定工作，同时也为草坪草转基因育种提供了相关依据，结合恰当的水肥调控，可有效提高草坪草的逆境耐受力，从而延长青绿期，提高生态价值。

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4 结 论

（1）本试验从正向和反向文库中分别随机挑选了384个克隆，利用斑点杂交共得到252个差异片段，库中阳性克隆约占50%以上。

（2）阳性克隆中，91个为上调基因，161个为下调基因。这些基因即为试验所要寻找的差异表达基因，他们与高羊茅的耐热性比密切相关。

（3）本试验为草坪草耐热基因的研究提供了基础，可进行后续的测序和功能鉴定工作，同时也为草坪草转基因育种提供了相关依据，结合恰当的水肥调控，可有效提高草坪草的逆境耐受力，从而延长青绿期，提高生态价值。

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