大花三色堇和角堇对高温胁迫的生理响应

陈宏志+杜晓华++穆金艳++贾文庆++刘会超

摘要：为研究高温胁迫下大花三色堇和角堇的生理响应，分别对大花三色堇DFM-16、DFM-17和角堇08H、E01幼苗进行不同温度胁迫处理，记录热害情况并测定不同胁迫条件下细胞膜透性、光化学效率（Fv/Fm）、脯氨酸含量、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性等生理指标。结果表明，角堇的热害指数高于大花三色堇；角堇细胞膜在高温胁迫下受损程度比大花三色堇细胞膜受损程度重；供试4种材料的光合作用在昼温42 ℃下均受到了抑制，且角堇比大花三色堇受抑制程度大；大花三色堇的脯氨酸含量基本上随温度的升高而升高；供试4种材料POD活性随着温度的升高出现不同程度的下降，大花三色堇SOD活性在昼温25、35 ℃下相对稳定，42 ℃时下降，大花三色堇的CAT活性在42 ℃下较对照均明显升高，而角堇明显下降。综合热害指数和生理指标分析得出，大花三色堇的耐热性高于角堇。

关键词：高温胁迫；大花三色堇；角堇；生理响应

中图分类号： S681.901文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）06-0124-03

大花三色堇（Viola tricolor L.）和角堇（Viola cornuta）均为堇菜科堇菜属的2年生草本花卉，具有花色丰富、花期长等特点，是世界著名的早春草本花卉[1-2]。自20世纪80年代开始，三色堇和角堇分别引入我国，在许多城市作为冬春季花坛用花，市场需求量巨大。在我国长江以南地区育苗主要在夏秋季进行，高温造成成苗率低及移栽死亡率高[3]。在我国华北地区，观赏期主要在春季，进入6月由于气温急速增高，导致植株逐渐枯萎死亡，缩短了观赏期。因此研究三色堇或角堇耐热机制，培育耐热品种成为当前三色堇园林应用及育种研究的重要课题。

植物往往采取一些策略应对高温胁迫，引起形态及生理指标的改变，一旦伤害已经造成，则难以恢复[4]。目前，仅见彭华婷等对大花三色堇幼苗在35 ℃胁迫下的生理变化进行了研究[3]。尚未见有关不同高温梯度下生理响应的探讨。本研究以2种大花三色堇和2种角堇为试验材料，对其幼苗进行不同温度的胁迫处理，记录在高温胁迫下幼苗的热害情况，测定不同温度下表征高温对植物伤害程度的细胞膜透性、光化学效率（Fv/Fm）和表征植物自我保护机制的脯氨酸含量、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）及超氧化物歧化酶（SOD）活性等指标，探究在高温胁迫下三色堇和角堇的生理响应，以期有助于采取相应措施减轻高温危害，为筛选抗高温基因型植株提供有效的途径，也为堇菜属观赏植物的耐热性研究寻找理论依据。

1材料与方法

1.1材料

供试大花三色堇和角堇分别引自德国和荷兰，由河南科技学院草花育种实验室提供，名称及来源见表1。在苗圃种植期间发现角堇08H、E01不耐高温，6月高温条件下植株开始枯萎死亡，而大花三色堇DFM-16、DFM-17在高温环境中能够维持较好的生长状态，因而推测后2种材料较前2种耐热。

1.2方法

1.2.1材料处理选取培育60 d、长势均匀的4种材料各100株，做好标记，在20 ℃—15 ℃（昼温—夜温），相对湿度90%～95%，光周期14 h的培养箱中驯化7 d，然后对驯化的4种材料分别进行不同温度胁迫，昼温—夜温分别为25 ℃—20 ℃（CK）、35 ℃—30 ℃、40 ℃—35 ℃、42 ℃—37 ℃，胁迫时间为 4 d，其间洒水2次/d，保持基质湿润。每种材料每个处理至少10株，重复3次。文中各处理用昼温简略表示。

1.2.2热害指数的测定记录4种材料在不同温度胁迫下4 d后的热害级数。

热害症状分级标准参照文献[5-6]：0级，幼苗生长正常，无明显热害症状；1级，叶片绿色，轻度反卷萎蔫；2级，叶片微黄，中度萎蔫；3级，叶片发黄，重度萎蔫；4级，植株茎萎缩，叶大部分枯黄萎蔫；5级，植株死亡干枯。热害指数=∑（每个级别植株数×级别数）/（最高级数×总植株数）×100%。

1.2.3生理指标的测定测定相对电导率：参照邹琦的方法[7]进行測定，每个处理重复3次，取平均值。

Fv/Fm：采用Yaxin-1161型叶绿素荧光仪测定可变荧光和最大荧光的比值来表征。选取完全伸展的叶片，暗适应 20 min 后进行测量，每个处理重复3次，取平均值。

脯氨酸含量测定：3%磺基水杨酸提取脯氨酸，进行茚三酮反应，用分光光度计比色[4]，每个处理重复3次，取平均值。

抗氧化酶活性测定：先制备粗酶液，准确称取样品0.5 g，放到4 ℃预冷的研钵中，往研钵中加入4 ℃预冷的50 mmol/L pH 值为7.8的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液1 mL，低温研至匀浆后转移到离心管中，再用3 mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液冲洗研钵并转入离心管中，4 ℃、10 000 r/min离心20 min，上清液即为粗酶液，4 ℃保存。用于测定CAT、SOD和POD活性。CAT、SOD和POD活性的测定均参照邹琦的方法[7]进行，每个处理重复3次，取平均值。

1.2.4统计分析采用Excel与DPS软件对数据进行方差分析和差异显著性检验。

2结果与分析

2.1高温胁迫下大花三色堇和角堇热害指数

在42 ℃高温胁迫下，4种材料叶片均出现发黄现象，随着胁迫时间的增加，角堇08H和E01部分植株先出现叶片枯萎，最后整株死亡。由表2可知，08H、E01的热害指数分别为0.75、0.68，二者差异不显著；DFM-16、DFM-17热害指数分别为0.45、0.38，二者差异不显著；08H与DFM-16、DFM-17之间，E01与DFM-16、DFM-17之间差异极显著，表明DFM-16、DFM-17的耐热性比08H、E01高，这与田间观察到的耐热性结果一致。

2.2高温胁迫对大花三色堇和角堇细胞膜透性的影响

由图1可知，不同温度胁迫下4种材料的细胞膜透性呈现不同的变化规律；08H在40、42 ℃胁迫下，细胞膜透性比对照（25℃）高；E01随胁迫温度的升高，细胞膜透性呈上升趋

势，且40、42 ℃与对照差异显著（P<0.05）；DFM-16在35、42 ℃胁迫下细胞膜透性比对照高，在40 ℃胁迫下无明显变化；DFM-17在35 ℃胁迫下较对照细胞膜透性下降，40、42 ℃ 条件下均小幅度升高，与对照差异均不显著。总体而言，08H和E01随温度的升高细胞膜透性变化比DFM-16和DFM-17大，说明大花三色堇DFM-16、DFM-17在高温胁迫下细胞膜受损程度小，而角堇08H、E01细胞膜受伤害程度大。

2.3高温胁迫对大花三色堇和角堇PSⅡ最大光化学效率（Fv/Fm）的影响

图2显示，在35、40 ℃胁迫下，除DFM-17外，其余3种材料较对照差异均不明显，说明在该温度下4种材料的PSⅡ最大光化学效率均表现出对该高温胁迫不敏感；与25 ℃胁迫相比，在 42 ℃ 时4种材料光化学效率均下降，说明42 ℃条件下4种材料的光合作用均受到了抑制，角堇08H和E01较大花三色堇DFM-16和DFM-17下降幅度大，说明后两者较前两者在高温条件下光合作用受到的抑制作用小，耐热性更强。

2.4高温胁迫对大花三色堇和角堇脯氨酸含量的影响

由图3可知，高温胁迫下08H脯氨酸含量较对照均下降；其余3种材料在40、42 ℃胁迫下脯氨酸含量较对照均明显上升；E01和DFM-16在35 ℃胁迫下较对照（25 ℃）有小幅度下降；随着胁迫温度的升高，DFM-16和DFM-17的脯氨酸含量升高，在42 ℃时最高，说明这2种材料对高温胁迫表现出了更强的适应性。

2.5高温胁迫对大花三色堇和角堇抗氧化酶活性的影响

由表3可知，42 ℃处理下，角堇08H与E01中POD、SOD、CAT活性相对对照（25 ℃）均有下降；在35、40 ℃处理下，E01中POD活性较对照下降，与25 ℃对照差异显著（P<0.05），而08H较25 ℃对照上升。

由表3还可见，大花三色堇DFM-16在35 ℃处理下POD活性低于对照（25 ℃），且两者差异极显著（P<0.01）；DFM-17在40、42 ℃下POD活性与对照（25 ℃）差异极显著（P<0.01），均明显下降，这说明高温会抑制POD的活性；DFM-16和DFM-17在35、40 ℃处理下SOD活性保持相对稳定状态，在42 ℃处理下DFM-17中SOD活性比对照（25 ℃）下降；在42 ℃时，DFM-16和DFM-17中CAT活性均明显升高，说明高温诱导了DFM-16和DFM-17中CAT活性升高，提高了植物对抗高温胁迫的能力。

3结论与讨论

高温胁迫对植物的伤害会引起光化学效率降低，这可能是光合内囊体膜受损、蛋白变性等引起的。PSⅡ最大光化学

效率的降低是光合作用受到抑制时的显著特征[8]。一般耐热性强的植物在高温下光合系统损伤较少，能够维持较高的光合速率[9]，这在条斑紫菜[10]、棉花[11]、苋菜[12]上均有研究证实。本试验也证明了这一点，4种材料PSⅡ最大光化学效率在42 ℃时均明显下降，光合作用均受到抑制。高温对植物伤害的另一方面是引起电解质外渗造成细胞膜受损，细胞膜是热损伤和抗热的中心，细胞膜的热稳定性反映了植物耐热能力的大小[13]。试验结果显示，随着温度的升高，角堇08H和E01细胞膜透性变化幅度大，细胞膜受损程度大，热害指数高，而大花三色堇DFM-16、DFM-17变化幅度小，热害指数低，可见大花三色堇DFM-16、DFM-17细胞膜更加稳定。

高温胁迫下植物会进行自我保护，一方面是防止水分过分损失，即渗透调节，渗透调节是植物耐热和抵御高温的重要生理机制[14]。脯氨酸作为渗透调节物质可以防止植物水分散失，提高原生质胶体稳定性，高温胁迫时，许多耐热的植物品种比不耐热的品种脯氨酸积累量多[15]。研究结果显示，隨温度的升高，大花三色堇DFM-16和DFM-17脯氨酸含量呈上升趋势，且增长幅度较08H与E01高，这表明大花三色堇较角堇对高温胁迫具有更好的适应性，耐热性更强。植物自我保护机制的另一方面是活性氧清除系统，活性氧清除系统在整个系统协调反应中能有效地控制活性氧含量，增加胁迫抗性[16]。高温对POD活性有显著的抑制作用，其活性的降低加速了高温对细胞结构和功能的损伤[17]。CAT和SOD是植物抗氧化防御系统中的关键酶，可以提高植物组织的抗氧化能力。研究结果表明，随着温度的升高，08H、E01、DFM-17的POD活性相对对照均在一定范围内出现不同程度的下降，这与吴国胜等在白菜上的研究结果[18-19]一致。4种材料的SOD活性在25、35 ℃下相对稳定，42 ℃时下降，这可能是由于42 ℃高温破坏了植物体内SOD酶的活性。DFM-16与DFM-17 CAT活性较对照均明显升高，而E01与08H的CAT活性则明显下降，这可能是因为在42 ℃时大花三色堇中的CAT没有遭到破坏，而角堇中CAT遭到了破坏。本试验中CAT和SOD活性的变化与彭华婷等对大花三色堇的研究[3]不完全符合，这可能是由于材料的差异引起的。

综合热害指数、细胞膜透性、光合效率、脯氨酸含量以及抗氧化酶活性等指标分析表明，大花三色堇2个品种的耐热性均高于角堇的2个品种。至于是否是所有的大花三色堇品种抗热性均高于角堇还有待于进一步研究。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.06.032