冷冻—溶解联合外源酶处理香草兰鲜豆荚对香气成分的影响研究

张彦军　徐飞　贺书珍　谭乐和

摘 要 香草兰是兰科多年生藤本攀缘植物，经过发酵后散发出多种芳香成分成为重要的风味原料。然而，传统发酵生香时间长，香气成分转化率低。本试验考察冷冻-溶解联合不同外源酶处理对香草兰鲜豆荚主要香气成分的影响。结果表明：外源酶不仅可以提高香兰素的含量，还可提高其前体物质-葡糖香草醛的转化率。在此基础上，对比空白样品，所有冷冻-溶解联合外源酶处理后的香草兰中香兰素、对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸和香兰酸含量均显著增加，经过纤维素酶-果胶酶-β葡萄糖苷酶处理后的香兰素、对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸和香兰酸含量最高为5.660%、0.089%、0.069%和0.101%；相比于传统发酵和普通外源酶处理，所有冷冻-溶解联合外源酶处理香草兰鲜豆荚均显著增加香兰素含量（p<0.05），而纤维素酶-果胶酶-β葡萄糖苷酶、果胶酶-β葡萄糖苷酶、纤维素酶-β葡萄糖苷酶、纤维素酶-果胶酶、果胶酶显著增加对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸和香兰酸含量（p<0.05）。

关键词 香草兰；冷冻-溶解；外源酶；主要香气成分

中图分类号 TS255.2 文献标识码 A

The Effect of Freezing-thawing Combined with Different Exogenous

Enzymes on Main Aroma Components of Fresh Vanilla Pods

ZHANG Yanjun1，2， XU Fei1，2， HE Shuzhen1，2， TAN Lehe1，2 *

1 Spice and Beverage Research Institute， CATAS， Wanning， Hainan 571533， China

2 National Center of Important Tropical Crops Engineering and Technology Research， Wanning， Hainan 571533， China

Abstract Vanilla which belongs to Orchidaceae is a perennial vine plant. A variety of aromatic components would be produced after fermentation. The traditional curing process of vanilla led to long fermentation time and low conversion rate of the aroma components. This study investigated the effect of freezing-thawing combined with different exogenous enzymes on main aroma components of fresh vanilla pods. Results showed that exogenous enzymes could not only improve the content of vanillin，it also could improve the conversion rate of its precursor substances（glucovanillin）. In addition， compared to blank samples， all the samples showed significant increase of vanillin，p-hydroxybenzaldehyde， p-hydroxybenzoic acid and vanillic acid after freezing-thawing combined with different exogenous enzymes treatme， in which it showed the highest content of vanillin， p-hydroxybenzaldehyde， p-hydroxybenzoic acid and vanillic acid with 5.660%， 0.089%， 0.069% and 0.089% after cellulose-pectinase-β-glycosidase treatment. Compared with the traditional fermentation and exogenous enzyme treatments， all the samples showed significant increase of vanillin（p<0.05）. However， only the samples showed significant increase of p-hydroxybenzaldehyde， p-hydroxybenzoic acid and vanillic acid after freezing-thawing combined with cellulose-pectinase-β-glycosidase， pectinase-β-glycosidase， cellulose-β-glycosidase， cellulose-pectinase， pectinase treatments（p<0.05）.

Key words Vanilla； Freezing-thawing； Exogenous enzyme； Main aroma components

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.12.026

香草兰（Vanilla planifolia Andrews）又名香荚兰、香子兰、香果兰，属兰科（Orchidaceae）香子兰属多年生热带藤本植物。香草兰是世界食品、饮料、化妆和香烟行业最重要和芳香的原料成分[1]。香草兰也是兰科家族中唯一生产用以作为商业上重要的风味原料。充分生长和成熟的香草兰豆荚被称为香草兰豆，鲜豆荚仅有青草香。香草兰传统发酵生香过程包括杀青、发酵、干燥、陈化生香，最终形成组分复杂的香气，包括烷烃、醇类、醛酮类、酯类、酚类、酸类，少量苯、醚类等[2-3]。如图1所示，香草兰发酵过程产生的主要香气成分是香兰素、香兰酸、对羟基苯甲醛和对羟基苯甲酸[2]。最近研究表明，香草兰鲜豆荚中主要香气成分糖苷干基含量在15%～20%之间，然而传统发酵生香转化率低为2%～3%[3-4]。

目前香草兰传统发酵生香技术比较成熟，但发酵时间长，主要香气成分转化率低。外源酶处理发酵香草兰豆荚或鲜豆荚的报道较多，但都集中在提高香兰素含量的研究。Odoux[3]、Ansaldi[5]研究表明，通过冷冻和融化处理破坏细胞壁完整性，提高香草兰中香兰素的含量。Mane、Zucca[6]研究表明，外源添加果胶酶和β-葡萄糖苷酶处理发酵好的香草兰豆荚可以显著提高香兰素含量。Gu等[7]考察纤维素酶添加量、温度和加热时间对提取香草兰中香兰素的影响，结果表明在优化条件下香兰素提取率达到7.62 mg/g。Brunerie[8]考察外源添加纤维素酶、果胶酶和β-葡萄糖苷酶可以显著提高香兰素含量。Ovando等[9]采用纤维素酶预处理香草兰鲜豆荚增加香兰素释放速度。Ruiz-Terán等[10]使用戊聚糖复合酶和纤维素酶两步法将香草兰中香兰素含量提高了3.13倍。Waliszewski等[11]采用3种纤维素酶制剂预处理的香草兰切段豆荚香兰素含量增加2倍。Naidu等[12]采用茶叶酶或者戊聚糖复合酶辅助提取香草兰鲜豆荚中的香兰素，含量高达4.2%。Perera和Owen[13]表明联合机械和冷冻处理后外源添加果胶酶、纤维素酶和β-葡萄糖苷酶可以使香兰素含量达到7%。虽然国内外预处理或外源添加酶对香草兰提取香兰素的影响研究报道较多，但未见外源酶处理香草兰鲜豆荚对除香兰素之外的主要香气成分影响的报道。

本课题组前期发现外源添加纤维素酶和果胶酶处理香草兰鲜豆荚可以大大提高香兰素的提取率[14-15]，在此基础上，本试验拟通过外源酶法处理（果胶酶、纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、戊聚糖酶和复合酶）香草兰鲜豆荚，对比单独添加外源酶和复合酶的差异性，以便在保证成本的基础上寻求主要香气成分含量最高的香草兰提取工艺，为香草兰的深加工、品质控制提供借鉴和参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试植物及药品 成熟伴有底部微微发黄无开裂的香草兰豆荚2014年11月采自兴隆热带植物园；香兰素、香兰酸、对羟基苯甲醛和对羟基苯甲酸标准品购买于Sigma公司；纤维素酶（15 000 U/g）购买于国药集团化学试剂有限公司；果胶酶（30 000 U/g）购于阿拉丁试剂公司；β-葡萄糖苷酶（9 300 U/g）购于sigma公司；戊聚糖复合酶（100 FBG/g）购于诺维信酶制剂公司；无水乙醇、冰醋酸（均为分析纯）购于天津天大化工实验厂。

1.1.2 仪器与设备 150HL250HL恒温恒湿干燥箱（上海一恒科学仪器公司）；RT5高效多点加热磁力搅拌器（德国IKA公司）；Agilent1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Milli-Q超纯水器（美国Millipore公司）；KQ-600B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；索式抽提器（蜀牛玻璃仪器公司）。

1.2 方法

1.2.1 水分测定 采用GB/T 5009.3-2003测定。

1.2.2 传统发酵法 根据Dignum等[2]方法进行部分修改，500 g一级香草兰鲜豆荚首先于70 ℃杀青1.5 min，于恒温恒湿箱保持相对湿度为95%，温度为60 ℃发汗3 h，50 ℃发汗3 h，45 ℃发汗3 h，40 ℃发汗18 h，干燥粉碎备用，经测定香草兰鲜豆荚和发酵好的豆荚水分含量分别为86.19%和15.20%。粉碎的香草兰粉末根据Zhang等[15]的方法进行索式提取，提取的溶液上高效液相检测葡糖香草醛、香兰素、对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸和香兰酸。

1.2.3 冷冻-溶解处理 冷冻-溶解处理方法根据Perera等[13]的方法做适当修改，选取新鲜的一级香草兰豆荚每5根真空包装成一袋，置于超低温冰箱-40 ℃处理24 h，于37 ℃溶解，经处理后的豆荚称为冷冻-溶解豆荚。

1.2.4 外源酶处理法 参照莫丽梅等[14]、Zhang等[15]的方法并作部分修改，准确称取一级香草兰鲜豆荚和冷冻-溶解香草兰豆荚各200.0 g，按重量比1 ∶ 1加入水打浆，打浆后香草液pH为5.4，平均分成20份，每份20 g，在指定温度下分别加入纤维素酶、果胶酶、β葡萄糖苷酶、戊聚糖复合酶和单酶组成的复合酶，另取一份20 g香草兰浆液同样条件不加酶作为空白对照，酶解8 h后，于沸水浴中保温10 min灭酶。滤液冷却后加入无水乙醇，使无水乙醇的体积分数为47.5%，室温下醇提30 min，过滤，定容得到香兰素浸提液，样品待上高效液相检测计算葡糖香草醛、香兰素、对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸和香兰酸含量。

1.2.5 不同处理香草兰豆荚中主要香气成分测定

根据Naidu[12]的方法略作修改，主要香气的检测采用安捷伦1260高效液相色谱法，仪器配备反相色谱柱Agilent ZORBAX XDB-C18（5 μm，4.6 mm×150 mm），柱温设定为30 ℃；流动相乙腈与水按照体积比设定为10 ∶ 90，流速设定为1.0 mL/min；所有标准品配成浓度分别为20、40、60、80、100和120 μg/mL的溶液，设定进样量为5 μL，每个样品进样3次，紫外检测波长设定为280 nm，灵敏度为0.01AUFS。样品在上机分析之前要过0.45 μm膜。以色谱峰的峰面积积分与对应标准品浓度作图绘制标准曲线，根据标准曲线计算不同处理香草兰豆荚中主要香气成分含量，含量统一以干基含量（%）表示。

1.3 数据分析

采用SPSS 12.0.1计算每组数据的平均值、标准偏差和显著性差异，显著性差异设定置信区间为95%（最小显著性差异的方法，p<0.05），所有试验结果均重复3次。

2 结果与分析

2.1 外源酶处理对香草兰鲜豆荚主要香气成分的影响

2.1.1 葡糖香草醛和香兰素 如图2所示，新鲜香草兰鲜豆荚中香兰素前体物质-葡糖香草醛含量为11.38%，而香兰素含量为0.21%。所有外源酶处理后的香草兰中香兰素含量均显著增加，经过纤维素酶-果胶酶-β葡萄糖苷酶处理后的香兰素含量最高为4.68%。香兰素含量由高到低分别是纤维素酶-β葡萄糖苷酶、纤维素酶-戊聚糖复合酶、果胶酶-β葡萄糖苷酶、β葡萄糖苷酶、纤维素酶-果胶酶、戊聚糖复合酶、纤维素酶、果胶酶处理，对应香兰素含量分别为3.78%、3.59%、3.34%、3.21%、3.05%、2.36%、2.26%、1.68%，对应前体物质-葡糖香草醛含量分别为4.01%、4.34%、4.92%、5.19%、5.52%、6.94%、7.15%、8.35%。相比于传统发酵所得香兰素含量1.98%，除了果胶酶处理之外，其他外源酶处理均增加香兰素含量。传统发酵和鲜豆荚香兰素转化率分别为35%和4%，纤维素酶-果胶酶-β葡萄糖苷酶、纤维素酶-β葡萄糖苷酶、纤维素酶-戊聚糖复合酶、果胶酶-β葡萄糖苷酶、β葡萄糖苷酶、纤维素酶-果胶酶、戊聚糖复合酶、纤维素酶、果胶酶处理后香兰素转化率分别为71%、66%、63%、58%、56%、53%、41%、39%、29%。相比较于传统发酵生香，外源酶纤维素酶-果胶酶-β-葡萄糖苷酶、纤维素酶-β-葡萄糖苷酶、纤维素酶-戊聚糖复合酶、果胶酶-β-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、纤维素酶-果胶酶、戊聚糖复合酶、纤维素酶增加香兰素转化率分别为36%、31%、28%、23%、21%、18%、6%、4%。

2.1.2 对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸和香兰酸

如图3所示，新鲜香草兰豆荚中对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸和香兰酸含量太少未检出。传统发酵香草兰豆荚对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸和香兰酸含量分别为0.022%、0.023%和0.050%。经纤维素酶-果胶酶-β葡萄糖苷酶、纤维素酶-β-葡萄糖苷酶、纤维素酶-戊聚糖复合酶、果胶酶-β-葡萄糖苷酶、纤维素酶-果胶酶、β-葡萄糖苷酶、戊聚糖复合酶、纤维素酶、果胶酶处理后对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸和香兰酸含量分别为0.049%、0.041%和0.072%，0.041%、0.037%和0.067%，0.038%、0.034%和0.066%，0.036%、0.031%和0.051%，0.031%、0.029%和0.060%，0.029%、0.026%和0.054%，0.023%、0.025%和0.056%，0.027%、0.024%和0.053%，0.024%、0.016%和0.058%。相比于传统发酵，除果胶酶处理后的香草兰豆荚中对羟基苯甲酸含量降低外，其他经过外源酶处理后香草兰豆荚对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸和香兰酸含量均有不同程度增加，其中经过纤维素酶-果胶酶-β葡萄糖苷酶处理后对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸和香兰酸含量增加最显著（0.027%、0.018%和0.022%，p<0.05）。

2.2 冷冻-溶解联合外源酶处理对香草兰鲜豆荚主要香气成分的影响

2.2.1 葡糖香草醛和香兰素 如图4所示，新鲜香草兰鲜豆荚中香兰素前体物质-葡糖香草醛含量为11.38%，而香兰素含量为0.21%，经过冷冻-溶解处理后葡糖香草醛含量为10.21%，而香兰素含量为0.67%。空白对照葡糖香草醛含量为9.79%，而香兰素含量为0.98%。对比空白样品，所有冷冻-溶解联合外源酶处理后的香草兰中香兰素含量均显著增加，经过纤维素酶-果胶酶-β葡萄糖苷酶处理后的香兰素含量最高为5.66%。香兰素含量由高到低分别是果胶酶-β葡萄糖苷酶、纤维素酶-β-葡萄糖苷酶、纤维素酶-果胶酶、果胶酶、β-葡萄糖苷酶、纤维素酶-戊聚糖复合酶、戊聚糖复合酶、纤维素酶处理，对应香兰素含量分别为5.42%、5.11%、5.01%、4.96%、4.61%、3.98%、3.22%、2.98%，对应前体物质-葡糖香草醛含量分别为0.62%、1.26%、1.47%、1.57%、2.27%、3.59%、5.17%、5.66%。相比于传统发酵所得香兰素含量1.98%，所有冷冻-溶解联合外源酶处理香草兰鲜豆荚均显著增加香兰素含量（p<0.05）。传统发酵和空白组香兰素转化率分别为35%和17%，纤维素酶-果胶酶-β-葡萄糖苷酶、果胶酶-β-葡萄糖苷酶、纤维素酶-β葡萄糖苷酶、纤维素酶-果胶酶、果胶酶、β-葡萄糖苷酶、纤维素酶-戊聚糖复合酶、戊聚糖复合酶、纤维素酶处理后香兰素转化率分别为98%、94%、89%、87%、86%、81%、70%、56%、52%。相比较于传统发酵生香，冷冻-溶解联合外源纤维素酶-果胶酶-β-葡萄糖苷酶、果胶酶-β-葡萄糖苷酶、纤维素酶-β-葡萄糖苷酶、纤维素酶-果胶酶、果胶酶、β-葡萄糖苷酶、纤维素酶-戊聚糖复合酶、戊聚糖复合酶、纤维素酶增加香兰素转化率分别为63%、59%、54%、52%、51%、46%、35%、21%、17%。

如图4所示，对比未经过冷冻-溶解的外源酶处理，经过冷冻-溶解联合外源纤维素酶-果胶酶-β-葡萄糖苷酶、果胶酶-β-葡萄糖苷酶、纤维素酶-β-葡萄糖苷酶、纤维素酶-果胶酶、果胶酶、β-葡萄糖苷酶、纤维素酶-戊聚糖复合酶、戊聚糖复合酶、纤维素酶处理增加香兰素含量分别为2.93%、2.08、1.96%、1.75%、1.33%、1.26%、0.98%、0.72%、0.39%，香兰素转化率分别提高52%、46%、34%、30%、23%、17%、15%、13%、7%。

2.2.2 对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸和香兰酸

如图5所示，新鲜香草兰豆荚中对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸和香兰酸含量太少未检出。传统发酵香草兰豆荚和空白对照组对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸和香兰酸含量分别为0.022%、0.023%和0.050%，0.024%、0.011%和0.038%。经冷冻-溶解联合外源纤维素酶-果胶酶-β-葡萄糖苷酶、果胶酶-β-葡萄糖苷酶、纤维素酶-β-葡萄糖苷酶、纤维素酶-果胶酶、果胶酶、β-葡萄糖苷酶、纤维素酶-戊聚糖复合酶、戊聚糖复合酶、纤维素酶处理后对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸和香兰酸含量分别为0.089%、0.069%和0.101%，0.053%、0.042%和0.083%，0.076%、0.046%和0.072%，0.039%、0.039%和0.067%，0.046%、0.034%和0.068%，0.048%、0.025%和0.059%，0.041%、0.042%和0.064%，0.029%、0.032%和0.061%，0.030%、0.027%和0.056%。相比于传统发酵，经过冷冻-溶解联合外源酶处理后香草兰豆荚对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸和香兰酸含量均增加，其中经过纤维素酶-果胶酶-β-葡萄糖苷酶处理后对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸和香兰酸含量增加最显著（0.067%、0.046%和0.051%，p<0.05）。

如图5所示，与未经过冷冻-溶解的外源酶处理相比，冷冻-溶解联合外源纤维素酶-戊聚糖复合酶、戊聚糖复合酶和纤维素酶对香草兰中对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸和香兰酸含量无显著性影响，然而纤维素酶-果胶酶-β葡萄糖苷酶、果胶酶-β-葡萄糖苷酶、纤维素酶-β-葡萄糖苷酶、纤维素酶-果胶酶、果胶酶均显著增加对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸和香兰酸含量（p<0.05），增加量分别为0.04%、0.028%和0.029%，0.018%、0.011%和0.032%，0.035%、0.009%和0.005%，0.008%、0.010%和0.007%，0.017%、0.008%和0.014%。β-葡萄糖苷酶对对羟基苯甲酸含量影响显著（p<0.05），含量增加0.009%，而对对羟基苯甲醛和香兰酸含量无显著影响。

3 讨论与结论

据Odoux[4]报道，香草兰鲜豆荚中香气成分主要以糖苷类底物存在，其中最重要的香气成分就是香兰素，是由前体物质-葡糖香草醛经过发酵过程中内源β-葡萄糖苷酶水解产生。另据Ranadive[16]报道，除了对香草兰风味起重要作用的香兰素，还存在对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸，它们均以葡糖甙的形式存在，香草兰中这4种成分被称之为主要香气成分。

由本试验的结果可知，相比于传统发酵方法，外源纤维素酶-果胶酶-β-葡萄糖苷酶、纤维素酶-β-葡萄糖苷酶、纤维素酶-戊聚糖复合酶、果胶酶-β-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、纤维素酶-果胶酶、戊聚糖复合酶、纤维素酶处理香草兰鲜豆荚均可显著增加香兰素含量。Ruiz-Terán等[10]研究表明采用戊聚糖复合酶和纤维素酶处理香草兰鲜豆荚分别得到2.45%和2.70%的香兰素，此结果与本文所得的2.36%和2.26%相似。Perera和Owen[13]研究表明采用果胶酶、纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和果胶酶-纤维素酶-β-葡萄糖苷酶处理香草兰鲜豆荚分别得到1.4%、3.7%、4%和7%的香兰素。本试验中果胶酶、纤维素酶、β-葡萄糖苷酶处理香草兰鲜豆荚香兰素含量分别为1.68%、2.26、3.21%。与Ruiz-Terán等[10]的结果差异是由于采用了不同地方的香草兰豆荚，除产地之外，栽培的气候和栽培条件也可能对香兰素含量产生影响。Naidu等[12]采用戊聚糖复合酶辅助提取香草兰鲜豆荚中的香兰素，含量为2.59%，与本试验的戊聚糖复合酶处理所得结果相似。

在外源酶基础上，本文采用冷冻-溶解联合外源酶处理香草兰鲜豆荚，结果表明冷冻-溶解联合外源酶处理香草兰鲜豆荚可以显著提高香兰素转化率和香兰素含量，也可以显著提高对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸和香兰酸含量。这可能是由于新鲜香草兰豆荚的细胞是完整的，普通的外源酶因果胶和纤维素等物质的隔离不能完全与底物接触，经过冷冻处理会破坏细胞壁，在果胶酶、纤维素酶水解果胶和纤维素使得β-葡萄糖苷酶与底物可以充分接触从而提高香兰素的含量。Perera和Owen[13]表明冷冻-溶解联合果胶酶-纤维素酶-β-葡萄糖苷酶处理香草兰鲜豆荚得到7%的香兰素。而本试验冷冻-溶解联合果胶酶-纤维素酶-β-葡萄糖苷酶处理香草兰鲜豆荚得到5.66%的香兰素。结果的不同是由于采用的是汤加的豆荚，含有超过15%的葡糖香草醛，经过全部转化可产生超过7.2%的香兰素，而本试验采用的豆荚是海南产，含有11.8%的葡糖香草醛，经过全部转化可产生5.72%的香兰素。Naidu等[12]采用茶叶酶辅助提取香草兰鲜豆荚中的香兰素，含量为4.2%，与本试验采用纤维素酶-果胶酶-β-葡萄糖苷酶处理所得结果相似。Odoux等[4]表明通过冷冻-融化联合内源β-葡萄糖苷酶处理破坏细胞壁完整性，得到2.3%的香兰素含量。Waliszewski等[11]采用3种纤维素酶制剂预处理的香草兰切段豆荚得到的香兰素含量。Ranadive[16]表明香草兰鲜豆荚杀青后外源添加β-葡萄糖苷酶提高对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸和香兰酸含量（22.5‰、2.8‰、8.9‰）。与Ranadive[16]结果相比，本试验采用冷冻-溶解联合外源酶处理得到的对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸和香兰酸含量更高。这可能由于瞬时微波杀青虽然会破坏细胞完整性，但是没有本实验中采用冷冻-溶解破坏香草兰细胞数量多，虽然添加β-葡萄糖苷酶，但由于部分细胞未被破坏，加上即使细胞壁被破坏，仍然有果胶和纤维素等物质隔离β-葡萄糖苷酶和底物，而本实验中添加果胶酶、纤维素酶或其混合处理会显著增加对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸和香兰酸含量。

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