病毒性心肌炎脂联素表达及替米沙坦的干预效果

王亚玲　杨蓉　金鑫　连宏光　李拥军

病毒性心肌炎脂联素表达及替米沙坦的干预效果

王亚玲杨蓉金鑫连宏光李拥军

【摘要】目的探讨替米沙坦对病毒性心肌炎小鼠脂联素，肿瘤坏死因子-α表达的影响。方法制备柯萨奇B3病毒感染的心肌炎小鼠60例，其中30例自病毒感染之日并连续7 d喂食替米沙坦作为观察组;另外30例无药物干预的心肌炎小鼠作为对照组;10例未感染病毒也无药物干预的小鼠作为空白组。观察3组小鼠的心肌病理组织学积分;组织病理改变;双抗体夹心酶联免疫法测定血清脂联素、TNF-α浓度。结果喂食替米沙坦的观察组血清脂联素水平明显高于未药物干预的对照组，而TNF-α、病理积分均低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。与空白组相比，观察组血清脂联素、TNF-α、病理积分水平明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与空白组相比，对照组血清脂联素降低，而TNF-α、病理积分水平明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。对照组小鼠接种病毒后第7天，可见心肌水肿、炎性细胞浸润、心肌细胞变性坏死等，观察组心肌炎症细胞较对照组明显减少。结论替米沙坦能够增加对心脏有保护作用的脂联素表达，减少TNF-α的分泌，减少心肌炎症损伤。

【关键词】替米沙坦;病毒性心肌炎;脂联素;肿瘤坏死因子-α

项目来源:河北省医学科学研究重点科技研究计划(编号: 2009 0102)

作者单位: 050000石家庄市，河北医科大学第二医院心内科(王亚玲、杨蓉、金鑫、李拥军)，病理科(连宏光)

病毒性心肌炎是由病毒感染(尤其是柯萨奇病毒B)所致局限性或弥散性心肌炎性病变，其发病有逐年增高趋势，最终导致心力衰竭。目前临床尚无十分有效的病毒性心肌炎治疗方法。Kanda等［1］研究发现心肌细胞分泌表达脂联素，而脂联素能预防心室重构、心力衰竭的发生。血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂能诱导脂联素的表达，发挥心脏保护作用［2］。本研究观察比较具有过氧化物酶体增殖物激活型受体(peroxisome proliferator activited receptors，PPARs)激动剂效应的血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂替米沙坦干预后病毒性心肌炎小鼠心肌脂联素，肿瘤坏死因子-α水平的变化，从而探讨更有效改善病毒性心肌炎预后，减少心力衰竭发生的治疗方法，为临床实践提供理论指导。

1　材料与方法

1.1试验动物4～6周龄雄性清洁级，近交系BALB/C小鼠，由河北医科大学动物实验室提供(合格证号:冀1动字第04045)共计70只，体重约(16.5±1.1) g。动物室保持空气流通，相对湿度在60%左右，温度(22±2)℃。全部小鼠常规饲养，并全程观测记录一般情况。

1.2病毒柯萨奇B3 (CVB3) Nancy病毒株(由河北医科大学免疫教研室提供)经Hep2细胞活化增殖，CPE达75%以上时收获，其滴度107TCID50/0.1 ml。1.3操作方法

1.3.1模型的建立及分组: 70小鼠随机分为3组。制备柯萨奇B3病毒(CVB3)感染的心肌炎小鼠60只，注射部位常规消毒后，腹腔注射10-5即100TCID50/0.1 ml CVB3 0.1 ml，其中30只自病毒感染之日并连续7 d喂食替米沙坦(10 mg/kg，购自美国Sigma-Aldrich公司)作为观察组;另外30只无药物干预的柯萨奇B3病毒(CVB3)感染心肌炎小鼠作为对照组; 10只腹腔注射等量0.1 mmol/L磷酸盐缓冲液0.1 ml，未感染病毒也无药物干预的小鼠作为空白组。1.3.2实验方法: 3组存活鼠于实验第7天分别处死，摘眼球取血，3 000 r/min离心20 min，取血清，－20℃冰箱冻存用于待测脂联素，肿瘤坏死因子-α (TNF-α)水平。开胸无菌摘取心脏并沿左心室长轴切开称重，经4%多聚甲醛固定、脱水、浸蜡、包埋，切片。1.3.3观察指标:①3组小鼠的7 d存活率及一般情况。②组织病理学检查:心脏组织固定于10%甲醛缓冲液，心肌常规苏木精-伊红(HE)染色，光镜下观察心肌病理改变，并参照Rezkalla等［3］方法半定量计算心肌病理组织学积分，即每张切片随机取5个高倍视野，计算每个视野中炎性细胞浸润及坏死区域面积与整个视野面积之比，无病变计0分，病变面积＜25%计1分，25%～50%计2分，51%～75%计3分，＞75%计4分。③血清脂联素、TNF-α浓度经由双抗体夹心酶联免疫法测定，试剂盒由美国Santa Cruz公司提供，操作按说明进行。

1.4统计学分析应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以±s表示，数据不服从正态分布的，经对数转换后趋近正态分布，组间比较采用t检验，相关性比较采用Pearson相关分析及多重线性回归，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1一般情况病毒感染小鼠于感染2 d后逐渐出现表现精神不振，活动减少，体温降低，毛色晦暗无光泽，耸毛脱毛，刺激反应淡漠或易激惹，拒食，抽搐; 5～6 d开始出现死亡，第7天死亡数量5只(其中观察组1只，对照组4只)，空白组无发病及死亡。最后纳入实验研究的小鼠为65只。

2.2组织学检查

2.2.1小鼠心脏、体重变化:对照组小鼠体重减轻，心脏重量增加，但差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1　3组小鼠体重及心脏重量的变化　±s

表1　3组小鼠体重及心脏重量的变化　±s

组别　体重(g)　心脏重量(mg)空白组(n=10)17.3±6.7　92.5±8.4对照组(n=30)　14.3±3.2　110.2±9.9观察组(n=30)16.2±2.9　95.4±9.6

2.2.2心肌组织病理学改变:空白组小鼠心肌标本，在显微镜下观察心肌细胞排列紧密，无炎性细胞浸润。对照组小鼠接种病毒后第7天，可见心肌水肿，炎性细胞浸润，心肌细胞变性、坏死，心肌纤维被分割成条索状，有的心肌断裂。观察组小鼠治疗第7天，心肌炎症细胞较对照组明显减少，可见少量心肌纤维变性，坏死。见图1～3。

2.32组血清脂联素、TNF-α及病理积分比较观察组血清脂联素水平明显高于对照组，而TNF-α，病理积分均低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。与空白组相比，观察组血清脂联素，TNF-α，病理积分水平明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与空白组相比，对照组血清脂联素降低，而TNF-α，病理积分水平明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2　血清脂联素、TNF-α、病理积分比较　±s

表2　血清脂联素、TNF-α、病理积分比较　±s

注:与对照组比较，*P＜0.05;与空白组比较，#P＜0.05

组别　脂联素(μg/ml)　TNF-α(pg/ml)病理积分观察组(n=30)　8.03±0.09* #　55.9±2.78* #　0.56±0.08*#对照组(n=30)　6.02±0.08#　183.36±2.24#　1.51±0.12#空白组(n=10)7.12±0.08　36.45±3.19　0

3　讨论

病毒性心肌炎是由病毒感染所致的、以心肌细胞变性坏死和间质炎性细胞浸润及纤维渗出为主要病理变化的一种心血管内科常见疾病。病毒性心肌炎发病机制复杂，目前对本病的发病机制尚未完全明了。众多研究表明神经-内分泌系统亦参与了病毒性心肌炎的病理过程，导致心肌炎心肌重构和心功能不全的重要因素。

脂联素一种主要由脂肪组织分泌的重要调节激素。目前研究提示其与肥胖、糖尿病、冠心病、动脉粥样硬化、高血压、心肌肥厚及心力衰竭等多种内分泌及心血管疾病有关，Saegusa等［4］研究通过分子生物学技术，发现小鼠病毒性心肌炎模型，小鼠心肌能表达脂联素，同时坎地沙坦可以上调脂联素的表达，改善病毒性心肌炎的预后。Kanda等［5］研究发现限制能量摄入、降低体重可以诱导心肌脂联素的表达、分泌，减轻病毒性心肌炎小鼠的心肌损伤，降低死亡率。说明心肌分泌脂联素对心脏有保护作用。本实验研究发现对照组血清脂联素含量最低，与空白组及观察组比较有显著性差异，表明病毒性心肌炎时血清呈低脂联素水平。

图1　空白组小鼠心肌病理改变(HE×100)

图2　对照组小鼠心肌病理改变(HE×100)

图3　观察组小鼠心肌病理改变(HE×100)

近年来国外研究显示，替米沙坦是一种特殊结构的血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂，能激活PPAR-γ，调节血糖代谢，血脂代谢，抗炎、抗氧化，改善胰岛素抵抗和动脉粥样硬化。PPAR-γ在调节能量代谢、细胞分化、增殖、凋亡、炎性反应、内源性活性物质合成和分泌中发挥重要信使作用。研究发现PPAR-γ激动剂可导致肿瘤坏死因子、瘦素、抵抗素合成减少及脂联素合成增加; PPAR-γ激动剂通过直接通过血管紧张素受体AT1作用于脂联素启动子诱导脂联素的产生或拮抗TNF-α对脂联素启动子的抑制效应来阻止胰岛素抵抗患者的动脉粥样硬化性血管疾病的发生。本研究中，与空白组相比，第7天柯萨奇B3病毒(CVB3)感染的心肌炎小鼠对照组脂联素水平均明显降低，有显著统计学差异(P＜0.05)，而给予替米沙坦干预的观察组小鼠脂联素水平较对照组，空白组均明显升高，有显著统计学差异(P＜0.05)。心肌病理积分与血清脂联素水平呈负相关性(P＜0.05) ;给予替米沙坦干预的观察组小鼠TNF-α，病理积分水平均明显低于对照组，有显著统计学差异(P＜0.05)。从病理组织结果看，对照组小鼠接种病毒后第7天，可见心肌水肿，炎性细胞浸润，心肌细胞变性、坏死等，观察组心肌炎症细胞较对照组明显减少。提示替米沙坦能够增加对心脏有保护作用的脂联素表达，减少TNF-α的分泌，减少心肌损伤。从而，在病毒性心肌炎病理进程中发挥一定的抗炎，抗损伤，逆转心脏重构，改善心衰的作用。

参考文献

1Kanda T，Saegusa S，Takahashi T，et al.Reduced-energy diet improves survival of obese KKAy mice with viral myocarditis: induction of cardiac adiponectin expression.Int J Cardiol，2007，119: 310-318.

2Seiichiro S，Yu F，Takashi T，et al.Oral Administration of Candesartan Improves the Survival of Mice with Viral Myocarditis through Modification of Cardiac Adiponectin Expression.Cardiovasc Drugs Ther，2007，21: 155-160.

3Rezkalla S，Kloner RN，Khatib G，et al.Effect of metoprolol on the acute phase of Coxsackievirus B3 murine myocarditis.J Am Coll Cardiol，1988，12: 412-414.

4Saegusa S，Fei Y，Takahashi T，et al.Oral administration of candesartan improves the survival of mice with viral myocarditis through modification of cardiac adiponectin expression.Cardiovasc Drugs Ther，2007，21: 155-160.

5Kanda T，Saegusa S，Takahashi T，et al.Reduced-energy diet improves survival of obese KKAy mice with viral myocarditis: induction of cardiac adiponectin expression.Int J Cardiol，2007，119: 310-318.

Effect of telmisartan on the adiponectin expression in mice with viral myocarditis

WANG Yaling，YANG Rong，JIN Xin， et al.
Department of Cardiology，The Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China.

【Abstract】Objective To investigate the effect of telmisartan on the expression levels of adiponectin，tumor necrosis factor-α(TNF-α) in mice with viral myocarditis.MethodsThe animal models with viral myocarditis were induced by Coxsackie B3 virus in 60 mice in which 30 mice were given telmisartan by gavage from the day of viral infection for 7 days (observation group )，however，the other 30 mice without drug intervention were served as control group，and the other 10 mice without viral infection and without drug intervention were served as blank control group.The myocardial pathological changes and pathological score were observed，and the levels of serum adiponectin and TNF-αwere detected for three groups by double antibody sandwich enzyme-linked immune method.ResultsThe serum levels of adiponectin in observation group were significantly higher than those of control group，however，the serum levels of TNF-α and pathological score were obviously lower than those in control group (P＜0.05).As compared with those in blank control group，the levels of adiponectin，TNF-α，pathological score in observation group were significantly increased (P＜0.05).As compared with those in blank control group，the serum levels of adiponectin in control group were significantly decreased，however，the levels of TNF-α，pathological score were significantly increased (P＜0.05).The myocardial edema，inflammatory cells infiltration，myocardial cell degeneration and necrosis were found in control group at 7 days after viral infection，however，these changes were obviously.ConclusionTelmisartan can increase the expression levels of adiponectin having protective effects on heart，and can decrease the levels of TNF-α，thus which can relieve myocardial injury.

【Key words】telmisartan; viral myocarditis; adiponectin; tumor necrosis factor alpha

(收稿日期:2014－09－30)

通讯作者:杨蓉，050000河北医科大学第二医院心内科; E-mail: yangrong7203@163.com

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.08.002

【文章编号】1002－7386(2015) 08－1128－03

【文献标识码】A

【中图分类号】R 542.211