热应激对肉鸡血清内毒素含量和肝脏中TLR4 m RNA表达的影响

黄淑成，张义博，黄永宣，刘成荫，郝世秋，刘 伟，仝宗喜

（河南农业大学牧医工程学院，河南郑州450002）

热应激对肉鸡血清内毒素含量和肝脏中TLR4 m RNA表达的影响

黄淑成，张义博，黄永宣，刘成荫，郝世秋，刘 伟，仝宗喜

（河南农业大学牧医工程学院，河南郑州450002）

为探讨肉鸡热应激条件下血液内毒素对肝脏TLR4mRNA表达的影响，我们复制肉鸡热应激模型。应用鲎试剂法和分子生物学等方法检测不同热应激时间段内毒素和TLR4mRNA表达量的变化。试验结果显示，与对照组相比，热应激组肉鸡血清内毒素与TLR4mRNA在肝脏中的表达差异均极显著（P＜0.01）。表明热应激条件下内毒素含量的升高可以对肉鸡肝脏造成损伤。

肉鸡；热应激；内毒素；肝脏；TLR4mRNA

现代过分追求肉鸡的高生长率使肉鸡对环境的各种应激源表现出很高的敏感性。尤其对高温更敏感，特别是高密度饲养的肉鸡发生热应激更为常见。内毒素（LPS）是革兰阴性细菌外膜的重要成分，也是引起机体免疫反应的成分之一，正常生理条件下，体内内毒素水平很低，当受到外界刺激、环境改变时机体的肠道菌群紊乱，引起内毒素移位入血，刺激机体靶细胞产生炎症反应，严重的造成休克、多器官功能衰竭甚至死亡［1］。另外，有研究指出，Toll样受体4（TLR4）是LPS的受体或信号转导分子，并在信号转导中具有重要作用［2］。因此，检测LPS受体TLR4在肝脏中的表达变化对探讨内毒素对肝脏的损伤具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验动物健康的20日龄AA肉鸡50只，购自河南开封正大肉鸡繁育基地。

1.2 主要试剂细菌内毒素标准品、血液内毒素检测用1号液体处理剂（批号：1204240），2号液体处理剂（批号：1207090），细菌内毒素检查用水（批号：1209170），定量检测用鲎试剂（批号：1210072）：湛江博康海洋生物有限公司；TRIZol液：Amresric公司生产；RT-PCR试剂盒：美国Pro⁃mega公司生产。

1.3 主要器材BET-32M细菌LPS定量测定仪，天津市天大天发科技有限公司生产；XK96-4型微量振荡器，姜堰市新康医疗器械有限公司生产；小型台式高速冷冻离心机，Eppendorf公司生产；Mastercyder EpRealplex型荧光定量PCR仪：Ep⁃pendorf公司生产。

1.4 试验方法

1.4.1 试验分组参照李玉保等［3］肉鸡热应激病例模型复制方法，挑选20日龄AA肉鸡50只随机分成对照组（20只）和热应激组（30只），在常规环境中适应性饲养2周后进行热应激处理。试验开始后将热应激组环境温度在20 min内从（22℃± 1℃）升高至（38℃±1℃）。所有应试鸡在试验期间应禁食，自由饮水。

1.4.2 样品采集与处理在热应激持续2、5、10 h时分别对热应激组和对照组肉鸡进行心脏采血各5 mL，取0.5mL移至含有1号处理液的离心管中，采用鲎试剂法检测血清中内毒素含量。采血后将所有受试鸡剖杀，取肝脏组织于液氮中保存待测。

1.4.3 引物设计根据已经发表鸡的TLR4基因的mRNA序列［4］运用Primer Premier 5.0软件设计两对引物。TLR4引物序列：上游引物：5′-GAGA⁃ACCTCAATGCGATGC-3′，下游引物：5′-ATAG⁃GAACCTCTGACAACG-3′；GAPDH引物序列：上游引物：5′-TGAAAGTCGGAGTCAACGG-3′，下游引物：5′-ACGCTCCTGGAAGATAGTGA-3′。由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成（iPAGE级别）。

1.4.4 RT-PCR方法用TRIZol法对肝脏组织中TLR4总RNA进行提取，最后以cDNA为模板进行PCR扩增，并使用SYBR GreenⅠ对RT-PCT产物进行非特异性标记，并使用2-△△CT方法计算出TLR4mRNA相对定理表达结果。

1.4.5 数据处理试验涉及的数据采用SPSS17.0软件的One-Way ANOVA进行方差分析与多重比较，结果以“平均数±标准误”表示，并采用GraphPad Prism 5软件绘制数据图。

2 结果

2.1 临床表现热应激后，对照组肉鸡临床表现无明显变化。热应激组肉鸡表现为精神沉郁，活动减少，翅膀张开，部分肉鸡卧于笼底；呼吸困难，张口呼吸，呼吸频率加快，出现长时间的热性喘息，可明显观察到胸廓快速和剧烈的收缩与扩张。另外还发现部分肉鸡的粪便稀薄，饮水增加，用喙啄水沾湿羽毛。

2.2 血清内毒素的变化肉鸡血清中内毒素水平的变化见图1。随热应激时间的持续，试验组肉鸡血清中内毒素的含量表现急剧上升的趋势，热应激持续10 h左右时，血清中内毒素的量达到最高点。与对照组肉鸡相比，热应激2 h时试验组血清中内毒素的含量差异极显著（P＜0.01）；热应激5 h和10 h时试验组血清中内毒素的含量差异均极显著（P＜0.01）。

图1 热应激对肉鸡血清中内毒素水平的影响

2.3 TLR4受体mRNA在肝脏中表达的变化

2.3.1 TLR4受体RT-PCR溶解曲线的建立将不同稀释度的标准品作为模板，用荧光定量PCR仪将GAPDH和TLR4基因的溶解曲线进行检测。试验结果表明，GAPDH和TLR4的溶解温度分别是86.5℃和84.3℃。且GAPDH和TLR4溶解曲线都只有一个波峰，表明RT-PCR在扩增过程中无引物二聚体产生和非特异性产物扩增。

2.3.2 mRNA质量PCR检测经微量紫外分光光度计检测，所有样品的OD260/OD280值均在1.8～2.0之间，表明RNA样品纯度较好无蛋白质污染，达到后续试验的要求。通过琼脂糖凝胶电泳显示，肉鸡TLR4 mRNA扩增片段在200～300 bp之间与预期的272 bp相一致。肉鸡的内参基因GAPDH扩增片段在100～200 bp之间与预期的156 bp相一致（图2）。

图2 热应激肉鸡肝脏TLR 4受体m RNA产物凝胶电泳

2.3.3 TLR4受体mRNA在肝脏中的表达变化肝脏TLR4受体mRNA的相对表达变化见图3，与对照组肉鸡相比，热应激2、5、10 h时试验组TLR4 mRNA的表达量均呈差异极显著（P＜0.01）。同时，热应激组在热应激持续2 h时，TLR4mRNA的表达量是对照组的1.021倍；热应激持续5 h时，TLR4 mRNA的表达量是对照组的1.659倍；热应激持续10 h时，TLR4 mRNA的表达量是对照组的3.272倍。可见，随着热应激时间的延长，TLR4mRNA的表达量在迅速上升。

图3 荧光定量PCR分析TLR4在肝脏中变化

3 讨论

3.1 内毒素含量的变化肉鸡热应激后血清中内毒素含量升高，与对照组相比呈差异极显著（P＜0.01）（图1）。分析其原因可能是由于肠道的微生态平衡遭到破坏，引起细菌的大量繁殖与死亡，一方面通过肠道屏障移位的细菌和内毒素可以引起肠黏膜水肿，肠绒毛膜顶部细胞坏死脱落，并激活成纤维细胞产生TNF-α、IL-1等细胞因子破坏肠黏膜的屏障作用［5］；另一方面，肠黏膜缺血缺氧引起肠道产生过量酸性产物，使细胞代谢过程受阻并引发组织损伤，促使细胞外钙离子内流而使细胞组织水肿，引起上皮通透性增加。从而加重细菌和内毒素移位入血［6］。高洪等［7］研究发现，内毒素注入山羊静脉5 h后，肝脏表现明显的实质细胞退行性变化，肝小叶坏死，微血管淤血，血管内嗜中性粒细胞和淋巴细胞粘聚等病理变化。这提示内毒素能够引起肝功能损伤，抑制肝脏的解毒和清除机能。因此，肠道的屏障作用破坏后，大量的内毒素和细菌移位入血，随血液循环到达肝脏引起肝细胞的破坏，抑制肝脏的解毒功能，从而导致血液中内毒素含量急剧增加，对机体产生毒性作用。

3.2 TLR4受体mRNA在肝脏中的变化有试验显示，使用具有LPS反应缺陷的C3H/HeJ小鼠品系，在Beutler组显示TLR4是LPS的一个重要传感器［8］。有学者在小鼠进行的定点克隆研究中表明，LPS位座编码一种TLR4，该受体作为LPS受体复合物的跨膜成分在转导脂多糖（LPS）信号时起重要作用［2］。近年研究发现，TLR4是识别内毒素的主要受体，也是内毒素惟一的跨膜信号受体［9］。由于肝脏是LPS攻击的第一个靶器官，另外，革兰阴性菌引起机体损伤主要由LPS介导，所产生LPS首先到达肝脏与肝脏产生的急性期蛋白LBP结合，形成LPS-LBP复合物，再由LBP将LPS转移到细胞膜表面的CDl4上，在分泌蛋白髓样细胞分化蛋白-2的作用下与TLR4结合，TLR4形成同源二聚体信号传导到细胞内，主要通过MyD88-依赖的信号通路最终增强NF-κB抑制蛋白激酶（IκB kinase，IKK）活性，导致了IκB的磷酸化和降解，解除对NF-κB的抑制，NF-κB遂发生转位而进入细胞核，指导靶基因的转录，表达一系列的细胞因子、趋化因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12等。使机体产生系列的免疫应答［10-11］，最终引起肝细胞的损伤。

热应激刺激时，血清中内毒素含量急剧升高，大量的内毒素进入肝组织中，激活其特异性受体TLR4，使TLR4在肝脏中的表达量升高（图3），高表达的TLR4能使内毒素分子有足够的跨膜受体延续信号传导，扩大内毒素的各种生物学效应，对肝脏组织造成损伤。本试验研究结果显示，试验组肝脏TLR4mRNA表达量急速升高，在热应激10 h时达到最高值，是对照组TLR4 mRNA的3.272倍。表明LPS刺激肝脏TLR4mRNA的大量表达。LPS再激活TLR4下游信号途径，使NF-κB激活进入细胞核，指导靶基因的转录，表达TNF-α，IL-6等炎症因子，加剧肝脏组织炎症细胞浸润并使肝细胞变性、坏死。

可见，热应激对肉鸡机体的各种损伤过程中，内毒素起到了非常重要的作用，甚至造成肉鸡死亡。在肉鸡热应激治疗过程中，应考虑清除肠道细菌，降低机体中内毒素的危害作用，建立“菌毒并治”理念。

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Effects of heatstress on serum endotoxin content and the expression of Hepatic TLR4m RNA of Broilers

HUANG Shu-cheng，ZHANG Yi-bo，HUANG Yong-xuan，LIU Cheng-yin，HAO Shi-qiu，LIUWei，TONG Zong-xi
（College of Animal Science and Veterinary Medicine，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China）

To investigate endotoxin-induced changes in hepatic TLR4 receptor mRNA expression in broilers under heat stress，wemade animalmodel of heat stress.The variation of endotoxin content in serum was detected by Limulus reagent test and the endotoxin-specific receptor TLR4 in liver was detected by molecular biologymethods during heat stress.The results showed that the contents of endotoxin in serum and the activity of TLR4mRNA were significantly elevated（P＜0.01）in the testgroupcom⁃pared with the control group.Our data indicate that heat stress may cause higher purity of endotoxin and hepatic impairment in broilers.

broilers；heat stress；endotoxin；hepatic；TLR4 Cor responding author：TONG Zong-xi

S858.31

A

0529-6005（2015）12-0027-03

2014-10-10

黄淑成（1988-），男，兽医师，硕士，主要从事动物营养代谢病及中毒病研究，E-mail：121147067@qq.com

仝宗喜，E-mail：tongzx0329@sohu.com