猪圆环病毒2型重组腺病毒核酸扩增检测标准样品的研制

高志强，刘 环，林祥超，张 伟，乔彩霞，谷 强，蒲 静，张鹤晓

（1.北京出入境检验检疫局，北京朝阳100026；2.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛266109）

猪圆环病毒2型重组腺病毒核酸扩增检测标准样品的研制

高志强1，刘 环1，林祥超2，张 伟1，乔彩霞1，谷 强1，蒲 静1，张鹤晓1

（1.北京出入境检验检疫局，北京朝阳100026；2.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛266109）

为研制用于猪圆环病毒2型（PCV-2）核酸扩增检测（NAT）质量控制的标准样品，本研究将猪圆环病毒2型QD/2014株ORF2连接到缺陷型腺病毒穿梭质粒pacAd5 CMV K-NpA上，构建了重组穿梭质粒CMV-PCV-2-ORF2。将其与骨架质粒pacAd5 9.2-100线性化后共转染HEK293T细胞，经胞内重组获得了内含PCV-2-ORF2的重组腺病毒pacAd5 CMV-ORF2。采用PCR和基因测序方法对重组病毒鉴定后进行大量培养、分装和冻干，经均匀性和稳定性检验后对其进行了定值。结果表明，制备的标准样品均匀、稳定，PCV-2-ORF2基因含量为8.17×109GEq/mL，在HEK293细胞上的TCID50为3.56×107/0.05mL。本标准样品的研制成功为核酸检测标准物质制备开辟了一条新途径。

猪圆环病毒2型；ORF2；重组腺病毒；标准样品

猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2，PCV-2）呈世界性分布，在家猪和野猪体内均有发现。目前认为PCV-2是一种重要的猪病病原，可引起猪的多种疾病，称为PCV-2相关性疾病（PCV-2-associated diseases，PCVAD）。PCV-2感染可造成猪群免疫力下降，可导致多种疫苗免疫失败，并导致猪只死亡率增加，因此对养猪业影响巨大［1］。

PCV-2基因组包括2个主要的ORF，其中ORF2不仅是其主要结构蛋白基因，也是核酸扩增检测的靶区域［2］。PCV-2感染的确诊通常需要采用实验室检验方法进行，一般需检出病毒或其组分。由于核酸扩增检测方法（NAT）的特异和高效，目前已经成为PCV-2快速检测的首选方法并得到广泛应用，但采用NAT方法一般均需使用标准质控品或标准样品来确保结果的准确性。高质量的标准品应具有无生物安全风险，与被检样品状态相近，可全程质控、具有量值范围和一定精密度的特性［3-4］。由于病原的繁殖涉及生物安全问题，近年来，核酸标准物质越来越受到国际认可。目前动物疫病检测核酸标准物质主要有病原基因组核酸标准物质和具有检测意义的核酸片段标准物质，但制备这些标准物质的最大难点是准确定量问题。因此，探索能够容易定量的核酸检测标准物质成为热点。由于PCV-2在细胞上不导致病变，测定不致细胞病变的病毒TCID50较繁琐且受人为因素影响较大，将不致细胞病变病毒的具有检测意义的核酸片段重组到对人和动物无危害的病毒载体，重组病毒能够对特定细胞产生致细胞病变作用，这样对重组病毒的滴度测定可反映插入核酸片段的量。本研究首次以缺陷型人5型腺病毒为载体，将PCV-2 NAT检测靶区域ORF2重组到病毒中，获得重组腺病毒，在测得TCID50和其基因含量后，经检验和定值后，作为标准样品应用于检测质量控制，取得满意效果。

1 材料与方法

1.2 猪圆环病毒2型ORF2基因的扩增克隆以提取的PCV-2基因组DNA为模板，设计1对引物（序列见表1）经PCR扩增PCV-2-ORF2基因。反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min。将PCR产物纯化后克隆于pMD19-T，并进行鉴定。

1.3 重组腺病毒穿梭载体的构建使用Kpn I和Hind III对重组质粒pMD19-T-ORF2和腺病毒穿梭载体pacAd5 CMV K-NpA双酶切后，经连接转化构建CMV-PCV-2-ORF2重组穿梭质粒，并进行鉴定。1.4重组腺病毒在细胞HEK293T中的包装与增殖

应用Pac I对质粒CMV-PCV-2-ORF2与pacAd5 9.2-100线性化，纯化后共转染HEK293T细胞。同时，对质粒CMV-GFP与pacAd5 9.2-100进行相同操作，作为转染对照；正常的HEK293T作为细胞对照。当转染细胞出现70%以上CPE，且转染对照GFP出现大量荧光时，收集各组细胞。反复冻融3次后，于HEK293细胞中进行连续传代，对第7代重组腺病毒进行鉴定。

1.5 含PCV-2-ORF2基因的重组腺病毒的鉴定

将第7代pacAd5 CMV-PCV-2-ORF2接毒细胞、转染对照pacAd5 CMV-GFP接毒细胞以及正常HEK293细胞，离心取细胞沉淀后分别提取DNA和RNA。对于提取的RNA，利用DNAse I消化其中可能残留的DNA。使用表1扩增引物分别进行PCR和RT-PCR鉴定，RT反应条件为42℃60min，70℃15min，其他反应条件同1.2。对扩增产物进行测序鉴定。

1.6 含PCV-2-ORF2基因的重组腺病毒冻干将大量培养的第7代pacAd5 CMV-ORF2接毒细胞反复冻融3次后，去除细胞碎片，按照1%加入海藻糖作为冻干保护剂，无菌条件下按照0.5mL/瓶分装于西林瓶中，真空状态下冷冻干燥24 h。

1.7 均匀性和稳定性检验抽取10管冻干品，提取DNA并作103倍稀释。应用PCV-2荧光PCR方法在一次试验中测试10份DNA样品，每个样品设3个重复。采用最大二阶导数法获取Ct值；另对10管冻干品测定其TCID50，每个测2次。对获得数据用单因子方差分析进行统计处理。

在以下每种条件下放置6瓶：（1）室温20℃～25℃；（2）冷藏温度2℃～8℃；（3）-20℃。定期取样提取DNA作103倍稀释后保存于-80℃。3个月后，应用PCV-2荧光PCR方法在一次试验中进行测试，采用最大二阶导数法获取Ct值；另测定冻干品的TCID50。对结果采用成对双样本均数-t检验进行统计分析。

PRB安装在地下含水层当中，与地下水流方向垂直，以保证污染羽与反应介质能充分反应，当污染地下水流经PRB时，其中的污染物浓度能够被降低.目前常见的PRB结构类型有三种：连续墙式结构、漏斗-导水门式结构和灌注处理带式结构[22].其他结构如墙帘式PRB[23]、微生物反应墙[24]、虹吸式PRB[25]等都是在上述三种结构的基础上优化改进而来.

1.8 重组腺病毒的初步定值（GEq/mL和TCID50测定）

将纯化的质粒pMD19-T-ORF2，通过测定其260 nm的吸光度值，并推算拷贝数，系列稀释后制成外标品，应用荧光PCR方法间接测定标准品的拷贝数。另外，取冻干品还原后，分别作10倍梯度稀释（101～1012）测定其TCID50。

2 结果

2.1 PCV-2-ORF2基因PCR扩增结果以提取的PCV-2基因组DNA为模板，经PCR扩增获得大小为702 bp的目的片段（见图1），与预期结果相符。

表1 基因克隆及荧光PCR引物探针

图1 ORF2基因扩增结果

2.2 重组腺病毒穿梭载体的构建重组穿梭质粒CMV-PCV-2-ORF2经Hind III和Kpn I双酶切后，得到大小为702 bp的目的片段，测序结果与已知序列一致。

2.3 重组腺病毒在细胞HEK293T中的包装与增殖重组穿梭质粒与骨架质粒共转染24 h后，对照转染组可见少量荧光，10 d达峰；pacAd5 CMVORF2共转染5 d后，细胞发生明显细胞病变（CPE）；而正常HEK293T细胞不出现CPE（见中插彩版图2）。

2.4 含PCV-2-ORF2基因的重组腺病毒的鉴定结果结果显示，只有pacAd5 CMV-PCV-2-ORF2感染细胞提取的DNA和RNA经（RT-）PCR扩增均有约702 bp的扩增条带，扩增产物测序结果与预期一致。

2.5 含PCV-2-ORF2基因的重组腺病毒冻干以1%海藻糖作为冻干保护剂，真空状态下冷冻干燥24 h得到了冻干品。

2.6 均匀性和稳定性检验结果冻干品的均匀性检验结果经单因子方差分析，结果显示对于Ct值，F（20，9）=2.21，＜F0.05（2.39）；对于TCID50，值，F（10，9）= 1.75，＜F0.05（3.02）对于表明冻干品中被检物是均匀的。

稳定性检验数据经成对双样本均数-t检验进行统计分析显示，对于Ct值数据，t值分别为1.59和0.87；对于TCID50数据，t值分别为0.55和0.59。均＜t0.05（2.13）表明冻干后样品稳定性良好；Ct值和TCID50变化情况见图3。

图3 不同保存条件下稳定性结果

2.7 重组腺病毒的初步定值结果（GEq/mL和TCID50测定结果）采用荧光定量PCR检测，经线性回归，获得标准样品候选物PCV-2-ORF2基因含量为8.17×109GEq/mL。在HEK293细胞上的TCID50经测定为3.56×107/0.05mL。

3 讨论

目前，PCV-2是危害养猪业的一种重要病原，据报道PCV-2感染可导致猪场猪只死亡率的增加从2%～3%到14%～30%不等［1］。因此，使用快速、灵敏的PCV-2病毒检测方法用于养猪场疫情监测非常重要。基于NAT检测方法的特异、高效，目前已报道了很多基于NAT的PCV-2快速检测方法［5-6］。NAT检测方法属于相对复杂的生物测定方法，对于同样的样品，由于DNA提取方法效率的不同，寡核苷酸引物、探针的效率不同都会给检测结果带来差异，甚至出现不同的结果，进而影响结果的判定。

为保证检测质量，评估不同NAT检测方法效力和实验室检验能力，研制均匀、稳定，可进行量值传递的标准样品用于PCV-2的检测质控非常必要。目前用于PCV-2 NAT检测的质控品为灭活病毒和质粒DNA制备，或制备复杂需要生物安全设施，或虽制备简单，但不能质控DNA提取过程，而且易造成气溶胶污染。均存在明显不足之处，不能满足实际需求。由于PCV-1和PCV-2基因序列最大的差异也位于ORF2基因内，故目前检测PCV-2的NAT方法均以ORF2作为靶标进行设计［2］。腺病毒无囊膜，与PCV-2结构大体类似，而且背景清楚，使用安全方便，因此本研究经一系列试验制备了PCV-2重组腺病毒核酸扩增检测标准样品。

在腺病毒转染与扩繁过程中发现，HEK293T的转染效率高于HEK293，但HEK293T细胞用于繁殖病毒效价很低。故而在试验中先使用HEK293T细胞进行转染，转染成功后再使用HEK293细胞进行病毒扩繁，取得满意效果。均匀性和稳定性试验表明PCV-2重组腺病毒经分装冻干后，目标成分均匀、稳定。但标准样品的GEq/mL和TCID50的精确量值还需进一步的协作标定研究［3］。

综上所述，本研究研制的PCV-2重组腺病毒标准样品符合临床生物类标准样品的基本要求-均匀、稳定，与被测物品状态相近且具有量值，可用于PCV-2 NAT测试中DNA提取、扩增等全过程的质量控制，而且重组后的病毒能够对特定细胞出现致细胞病变作用，也可以通过对重组病毒的滴度测定间接了解插入的核酸片段的量。本核酸检测标准物质推广应用后可促进PCV-2 NAT检测方法的规范化和标准化。

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［3］World Health Organization.Recommendations for the preparation，characterization and establishment of international and other bio⁃logical reference standards［M］.WHO Technical Report Series No：932，2006：25-36.

［4］王露楠，吴健民，李金明，等.丙型肝炎病毒核酸检测的国家标准物质的研制［J］.中华检验医学杂志，2006，29（4）：354-357.

［5］Kai Zhao，Fangting Han，Yong Zou，etal.Rapid detection of por⁃cine circovirus type 2 using a TaqMan-based real-time PCR［J］.J Virol，2010，7：374-378.

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Establishment of Recombinant Adenovirus as Referencematerial for Porcine Circovirus Type 2 Nucleic Acid Am plification Technology（NAT）-based Assays

GAO Zhi-qiang1，LIU Huan1，LIN Xiang-chao2，ZHANGWei1，QIAOCai-xia1，GUQiang1，PU Jing1，ZHANGHe-xiao1
（1.Beijing Enrty-exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 100026，China；2.Animal scienceand Technology college，Qingdao Agricultural Vuiversity，Qingdao 266109，China）

Recombinant adenovirus containing PCV-2 ORF2 gene，whichmimics naturally DNA virus particles，can be used as candidate reference material for nucleic acid amplification technology（NAT）-based assays of PCV-2.In this paper，the com⁃plete ORF2 of PCV-2 stain QD/2014 was amplified and cloned to defective adenovirusshuttle plasmid pacAd5 CMV K-NpA to construct recombinant shuttle plasmid CMV-ORF2.When the linearized CMV-PCV2-ORF2 and backbone plasmid pacAd5 9.2-100 by Pac Iwere co-transfected into HEK293T cells，the adenovirus pacAd5 PCV-2 containing ORF2 were obtained by recombi⁃nation in vivo.Then the recombinant viruswhich was stable in propagation was verified by PCR and Sequencing.After propagation，aliquot，lyophilization，homogeneity and stability testing，the GEq/m l（gene equivalents/mL）and TCID50of the recombinant virus were determined.The result showed the prepared candidate referencematerial was homogeneous and stable with a value of 8.17× 109GEq/mL and 3.56×107/0.05mL（TCID50）.Based on the establishment of the PCV-2 candidate referencematerial，a new way for preparation of referencematerials for NAT-based assaywas developed.

Porcine circovirus type 2；ORF2；Recombinantadenovirus；Referencematerial

ZHANGHe-xiao

S852.65+1

A

0529-6005（2015）12-0010-03

2015-08-26

质检公益性行业科研专项“动物疫病核酸标准物质制备关键技术研究”（201310253）

高志强（1974-），男，研究员，博士，主要从事动物检验检疫研究，E-mail：gaozhiqiang02@163.com

张鹤晓，E-mail：aqlzhx@126.com