鸡pIgR多克隆抗体的制备及初步鉴定

李德军，刘运枫，宋 雪，任利敏

（东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨150030）

鸡pIgR多克隆抗体的制备及初步鉴定

李德军，刘运枫，宋 雪，任利敏

（东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨150030）

根据GenBank中鸡pIgR基因序列和蛋白序列，设计引物，利用PCR技术扩增胞外配体结合区片段，构建原核重组表达质粒pET-32a（+）/pIgR，将重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG的诱导表达融合蛋白，通过镍离子螯合柱纯化后免疫新西兰大白兔，获得兔抗鸡pIgR多克隆抗体，通过酶联免疫吸附试验（ELISA法）和Western Blot法检测抗体的效价和特异性。结果显示，成功制备特异性的鸡pIgR抗体，为研究鸡pIgR的功能提供有力依据。

鸡；pIgR；多克隆抗体

大多数病原体，尤其是通过黏膜侵入机体的病原对养禽业造成了巨大损失。所以，对禽类消化和呼吸系统疾病的预防，日益受到人们的重视。有研究表明，机体95%以上的感染发生在黏膜或由黏膜入侵机体［1］。而黏膜免疫主要是靠分泌型免疫球蛋白（SIgA）发挥作用。

SIgA不仅是抵抗环境中病原体入侵黏膜表面的第一道特异性免疫防线，还可以平衡体内共生的微生物群［2］。研究表明，SIgA的有效分泌依赖于pIgR（polymeric immunoglobulin receptor）的穿胞转运机制［3］。pIgR属于I型跨膜糖蛋白，分子量大小约为120 kDa［4］，它能够与多聚免疫球蛋A（pI⁃gA）和多聚免疫球蛋白M（pIgM）特异性结合，经过穿胞转运作用，将它们从上皮细胞基底侧膜转运到顶膜，并最终分泌到外分泌液中去，同时，释放出与pIgA/pIgM相结合的分泌成分（SC），从而形成分泌型IgA（即SIgA）。因此，pIgR不仅是pI⁃gA/pIgM的转运受体，同时也是SIgA的重要组成部分［5-6］。因而pIgR的有效分泌是多聚免疫球蛋白发挥黏膜防御功能的必要条件［7-10］，其在黏膜免疫中发挥着重要作用。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株及试验动物原核表达载体pET-32a（+），大肠杆菌感受态DH5、BL21（DE3）均由本试验室保存；21日龄SPF鸡与新西兰雄性大白兔，购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。

1.2 主要试剂TRIZol、M-MLV逆转录酶，购自上海Invitrogen生物技术有限公司；500 bpDNA Ladder（Dye Plus）、Taq DNA聚合酶，PCRBuffer、dNTP（2.5mmol/L），限制性内切酶BamH I、Xho I，T4 DNA连接酶，氨苄青霉素，IPTG和DAB显色液，购自大连TaKaRa生物技术有限公司；质粒小提及胶回收试剂盒，购自OMEGA公司；DNA Marker（DL-2 000）、Protein Marker（14～100 kDa/15～100 kDa），购自北京全式金生物技术有限公司；弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，购自Sigma公司；辣根酶标记的羊抗兔IgG，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 鸡PIGR胞外段cDNA的扩增根据NCBI上收录的鸡pIgR基因核苷酸序列，确定其胞外段基因序列，设计引物，并在上游F和下游R中引入限制性内切酶BamH I、Xho I的酶切位点。F：5′-CG GGATCC CCTCCCACCACGGTGAACA-3′；R：5′-CC CTCGAG GCCGTTCTTTGGGTTGTCAATGA-3′预测片段大小为801 bp，引物由上海Invitrogen生物技术有限公司合成。TRIZol法提取鸡空肠组织内总RNA，用M-MLV逆转录酶将其反转录成cD⁃NA。利用上述引物进行PCR扩增，扩增体系为Taq DNA聚合酶1μL，PCR Buffer 2.5μL，dNTP（2.5 mmol/L）2μL，上下游引物各1μL，cDNA模板2μL，RNase free ddH2O补至20μL。反应体系为95℃5min，95℃30 s，58℃30 s，72℃1min，35个循环，72℃10min。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测后，胶回收目的片段，-20℃保存备用。

1.4 pET-32a（+）/pIgR重组质粒的构建、筛选及鉴定将纯化后的PCR产物和pET-32a（+）质粒分别用限制性内切酶BamH I和Xho I进行双酶切，建立以下20μL双酶切体系：水2μL，10 K Buffer 2μL，纯化后PCR产物（pET-32a（+）质粒）14μL，BamH I和Xho I各1μL，37℃水浴3 h。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，胶回收目的片段，-20℃保存备用。取双酶切并纯化后的PCR产物及pET-32a（+）线性载体，建立以下10μL的连接反应体系：T4连接酶1μL，10×T4 Buffer 1μl，双酶切的PCR产物6μL，双酶切的pET-32a（+）线性载体2μL，16℃连接过夜。将连接产物转化到大肠杆菌感受态DH5α上，涂板培养后挑取单个菌落进行PCR和酶切鉴定。鉴定阳性菌液送至上海Invitrogen生物技术有限公司进行测序。

1.5 PIGR原核蛋白表达及收集将双酶切及测序鉴定正确的阳性重组质粒标记为pET-32a（+）/pIgR，并转化到大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）上，挑取单个菌落，转接于20mL含有1μL/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃条件下以200 r/min的速度于全温振荡器中振荡培养过夜。过夜培养菌液以1∶100的比例接种到含氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃条件下以200 r/min的速度振荡培养2.5 h后，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，37℃继续通气培养6 h，收集菌液，冰上超声破碎，工作15 s，暂停10 s，重复100次。12 000 r/min（4℃）离心15 min，收集不溶组分。将不溶组分用尿素处理，经镍离子螯合柱纯化后，收集蛋白。

1.6 兔抗鸡pIgR抗血清的制备将纯化后的融合蛋白与弗氏完全佐剂1∶1后，通过皮下多点注射免疫试验兔，初疫十天后，每周对试验兔用不完全佐剂抗原蛋白进行加强免疫，加强免疫四次后，对兔子进行心脏穿刺取血，约50mL，室温静置1 h后放入4℃冰箱中，静置过夜待血清充分析出，取血清用0.22μm孔径微孔滤膜过滤后，-20℃保存备用。用琼脂双向扩散试验检测抗血清效价。

1.7 Western Blot检测pIgR多抗特异性将诱导0 h和4 h的菌体全蛋白进行SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜；5%脱脂乳37℃封闭1 h；加入兔抗鸡pIgR抗血清（1∶1 000倍稀释）37℃孵育1 h；二抗为HRP标记的山羊抗兔IgG（1∶5 000倍稀释），37℃孵育1 h；TBST洗膜3次后，用DAB显色液显色，待阳性条带出现后滴加去离子水终止反应。

2 试验结果

2.1 鸡pIgR胞外段的克隆图1可见，PCR反应扩增的pIgR片段大小位于750 bp和1 000 bp之间，且条带单一，与预测的片段大小相一致，可以切胶回收，用于后续试验。

图1 pIgR片段的PCR扩增电泳

2.2 pET-32a（+）/pIgR质粒的构建及鉴定

2.2.1 pET-32a（+）空载体与pIgR片段的双酶切结果图2可见，pET-32a（+）质粒和pIgR片段经过BamH I、Xho I双酶切后的条带比较清晰，可以进行胶回收。

图2 pET-32a（+）空载体与pIgR片段经双酶切后的电泳

2.2.2 pET-32a（+）/pIgR质粒的双酶切结果如图3所示，阳性重组质粒经BamH I、Xho I双酶切后，得到了两条DNA片段，小片段与插入的双酶切的pIgR片段大小一致，说明pIgR片段已经正确插入到原核表达载体中。

图3 pET-32a（+）/pIgR重组质粒和pIgR片段经双酶切后的电泳检测

2.3 pIgR原核蛋白的诱导表达将鉴定阳性的重组质粒pET-32a（+）/pIgR转化到BL21（DE3）表达菌上，经IPTG诱导后，取不同时间段菌体，处理后进行SDS-PAGE电泳，用考马斯亮蓝染色鉴定，预期蛋白大小为48 kD左右，如图4所示，pIgR原核表达蛋白位于40 kD与62 kD之间，符合预期蛋白大小。

2.4 兔抗鸡pIgR抗血清的制备本次试验得到兔抗鸡pIgR抗血清约10mL，经琼脂双向扩散试验测定该抗血清的效价为1∶51 200。如图5所示，6 h表达菌中的pIgR蛋白能够和兔抗鸡pIgR抗血清进行特异性反应。

3 讨论

图4 原核重组蛋白电泳图及表达量分析M：蛋白Marker；1：0 h表达菌；2：2 h表达菌；3：4 h表达菌；4：6 h表达菌

图5 Western Blot DAB显色结果

pIgR不仅可以介导细胞内多聚免疫球蛋白的转运，还可以直接参与pIgA介导的保护机制。Mazanec M B等人的试验表明，pIgR除了在黏膜表面为机体提供SIgA，同时也是pIgA在组织和分泌型上皮细胞内发挥防御功能的必要条件［11］。近年来，与针对sIgA和pIgA/pIgM的研究相比，pIgR的相关研究还相对较少；与其相关的研究和报道多集中于哺乳动物和鱼类，而禽类pIgR的克隆、表达及其相关研究报道也相对较少。

因此本试验利用pET-32a（+）原核表达载体对鸡pIgR胞外配体结合区进行克隆。大肠杆菌表达系统具有高效、方便、培养条件简单、可操作性强等优点，是获取重组蛋白的重要表达系统［12］。pET-32a（+）原核表达载体使表达产物的氨基端带His标签，可以利用镍离子亲和柱进行蛋白纯化，获得高纯度蛋白。在预试验阶段，采用不同温度培养条件（37℃、22℃和16℃）以及不同的浓度的IPTG（0.2mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L和1.5mmol/L）条件下进行蛋白的诱导，通过对每一个条件组合下的表达量进行分析，最终确定以37℃1 mmol/L IPTG为最佳诱导条件。试验结果显示，此条件下蛋白表达量最大。通过ELISA和Western Blot检测抗体的效价及特异性，结果显示，该抗体具有较高效价，可以特异性识别pIgR蛋白。为进一步探讨pIgR的功能及深入了解pIgR在禽类黏膜免疫防御中的作用机理奠定了分子基础。

参考文献：

［1］高英杰.黏膜免疫向免疫学提出了新问题［J］.上海免疫学杂志，2000，20（5）：257-2591.

［2］Johansen F E，Kaetzel C S.Regulation of the polymeric immuno⁃globulin receptor and IgA transport：new advances in environmen⁃tal factors that stimulate pIgR expression and its role in mucosal immunity［J］.Mucosal Immunol，2011，4（6）：598-602.

［3］Wijburg O L，Uren T K，Simpfendorfer K，et al.Innate secretory antibodies protect against natural Salmonella typhimurium infec⁃tion［J］.ExpMed，2006，203（1）：21-26.

［4］Asano M，Komiyama K.Polymeric immunoglobulin receptor［J］. Oral Sci，2011，53（2）：147-156.

［5］Brandtzaeg P，Carlsen H S，Halstensen T S.The B-cell system in inflammatory bowel disease［J］.Adv ExpMed Biol，2006，579：149-167.

［6］Lewis M J，Pleass R J，Batten M R，et al.Structural requirements for the interaction of human IgA with the human polymeric Ig re⁃ceptor［J］.Immunol，2005，175（10）：6694-6701.

［7］Gurevich P，Zusman I，Moldavsky M，etal.Secretory immune sys⁃ tem in human intrauterine development：immunopathomorphologi⁃cal analysis of the role of secretory component（pIgR/SC）in immu⁃noglobulin transport（review）［J］.Intern JMol Med，2003，12（3）：289-297.

［8］Kaetzel C S.The polymeric immunoglobulin receptor：bridging in⁃nate and adaptive immune responses atmucosal surfaces［J］.Im⁃munol Rev，2005，206：83-99.

［9］Braathen R，Hohman V S，Brandzaeg P，et al.Secretory antibody formation：conserved binding interactions between J chain and polymeric Ig receptor from humansand amphibians［J］.JImmunol，2007，178（3）：1589-1597.

［10］唐庆娟，戚欣，耿美玉.多聚免疫球蛋白受体（pIgR）在黏膜免疫中的重要功能［J］.中国生物化学与分子生物学报，2007，23（9）：724-729.

［11］Mazanec M B，Nedrud J G，Kaetzel C S，et al.A three-tiered viewof the role of IgA in mucosal defense［J］.Immunol Today，1993，14（9）：430-435.

［12］Studier FW，Rosenberg A H，Duuu J，et al.Use of T7 RNA poly⁃merase to direct expression of cloned genes［J］.Methods Enzymol，1990，185：60-89.

Prelim inary identification and polyclonalantibody preparation of polymeric immunoglobulin receptor in chicken

LIDe-jun，LIU Yun-feng，SONG Xue，REN Li-min
（College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

A pair of primerswere designed clone the extracellular ligand binding area by RT-PCR on the basis of polymeric immunoglobulin receptor of chicken’s gene sequence and protein sequence from GenBank.The amplified segmentwas inserted to the expression plasmid pET-32a（+），and then the prokaryotic expression vector pET-32a（+）/pIgR was constructed.The plasmid was transformed into BL21（DE3）and induced by IPTG.The recombinant proteinswere purified by using Ni2+-NTA chelating col⁃umn.The purified proteinswere inoculated into New Zealand adult rabbits to developpolyclonal antibody against polymeric immu⁃noglobulin receptor of chicken.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）and Western blot were performed to evaluate the specificity of the prepared antibody.The results showed that the prokaryotic expression vector pET-32a（+）/pIgR was successfully constructed in this experiment.The polyclonal antibody of polymeric immunoglobulin receptor in chicken was generated and could be used to study the function of polymeric immunoglobulin receptor in chicken.

chicken；pIgR；polyclonal antibody

S858.31

A

0529-6005（2015）12-0013-03

2014-09-09

黑龙江省博士后启动金项目（LBH-Z11239）

李德军（1974-），女，副教授，博士，主要从事动物营养调控和新陈代谢疾病的研究，E-mail：ldjld j@163.com