昆仑雪菊黄酮提取物体外抗氧化活性试验

徐 斌，王 丹，葛红娟，宋春梅

（吉林医药学院公共卫生学院，吉林吉林132013）

昆仑雪菊黄酮提取物体外抗氧化活性试验

徐 斌，王 丹，葛红娟，宋春梅

（吉林医药学院公共卫生学院，吉林吉林132013）

为了研究昆仑雪菊黄酮提取物（KFE）体外抗氧化活性，采用超声法提取昆仑雪菊中黄酮，乙醇浓度95%、温度40℃、时间15 min，提取3次。经过测定1 g昆仑雪菊粉末中含有0.125 g黄酮。分别用普鲁士蓝还原法、水杨酸法、邻苯三酚自氧化法、DPPH法以及硫代巴比妥酸法测定不同浓度下KFE的还原能力，对羟自由基（·OH）、超氧阴离子（O2-）、DPPH自由基的清除能力以及对脂质过氧化的抑制率。结果表明，KFE还原能力随浓度上升而增强，但弱于维生素C；对羟自由基清除能力在110 g/mL最强，清除率为18.72%，高于维生素C；清除超氧阴离子的能力弱；DPPH自由基清除能力在302.5 g/mL最强，清除率为94.47%；脂质体系抗氧化能力在605 g/mL最强，抑制率为54.22%。结果表明，KFE具有一定的抗氧化活性。

昆仑雪菊；黄酮；抗氧化

昆仑雪菊又名天山雪菊、冰山雪菊、高寒香菊，生长于海拔3 200m以上的高寒山区，是惟一与雪莲齐名且具有独特功效的稀有高寒野生植物。由于产地污染少，兼之含有糖类、黄酮类、皂苷类、有机酸、鞣质、挥发油或油脂类［1］等多种活性成分，使其具有清热解毒、活血化瘀和健胃脾、降血糖、糖耐受、降血脂、降血压、抗氧化、抗凝血等功效［2］，其中黄酮类化合物（flavonoids）含量最为丰富。黄酮类化合物是一类广泛分布于植物界的多酚类化合物，主要存在于植物的叶、花、根、茎、果实中，是植物在长期自然选择过程中产生的一类次级代谢产物。据研究发现，黄酮对防癌抗癌、抗肿瘤、防心血管疾病、防骨质疏松、消除自由基和抗氧化活性、雌激素和抗雌激素样作用等均有积极影响［1］，得到国内外专家学者的广泛重视。随着对抗氧化剂的认识，国内外学者对于植物中存在的天然抗氧化剂的研究越来越多。国内外关于昆仑雪菊的结构解剖学研究及其化学成分的研究已有报道［3-4］，但有关其系统抗氧化活性分析很少。本文主要探讨昆仑雪菊黄酮提取物体外抗氧化活性［5-7］。通过测定昆仑雪菊黄酮提取物的还原能力、对自由基清除能力和对脂质体系抗氧化能力，并通过与抗坏血酸的对比来研究其抗氧化活性，为昆仑雪菊作为天然抗氧化剂和药用植物提供一些理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料新疆昆仑山脉昆仑雪菊。

1.2 仪器与试剂FZ102微型植物粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；202-1AB电热恒温干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；FA1104N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；KQ-100DB数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；TD5A离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）；RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；722可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；HHS电热恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；90-2定时恒温磁力搅拌器（上海精科实业有限公司）；试剂为市售分析纯。

1.3 芦丁标准曲线绘制芦丁标准溶液：精确称取经干燥恒重的芦丁标准品7.5mg，加甲醇溶解并定容至100mL，配成75μg/mL芦丁标准溶液。

绘制标准曲线：准确吸取75μg/m L的芦丁标准溶液0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL（相当于含芦丁0、37.5、75、150、225、300μg），移入10mL刻度比色管中，加入30%乙醇溶液至5 mL，各加质量分数5%NaNO2溶液0.3mL，振摇后放置5min，加入质量分数10%Al（NO3）3溶液0.3 m L摇匀后放置6 min，加质量分数4%NaOH溶液2 mL，再加30%乙醇定容至刻度，摇匀，放置15min。以零管溶液作参比溶液，于510 nm波长处测定各管吸光度值，以芦丁含量（μg）为横坐标，以吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，见图1。

试验所得芦丁标准曲线为y=0.0012x-0.0002，该曲线的相关系数R2=0.9999。

图1 芦丁标准曲线

1.4 原料中黄酮提取及体外抗氧化活性测定用微型植物粉碎机将昆仑雪菊粉碎，过60目网筛，得到昆仑雪菊粉末。准确称取昆仑雪菊粉末1 g（3份），加入15 mL 95%乙醇液，40℃、80W超声提取15min，以3 000 r/min离心10min，取上清液；将沉淀继续加入15mL 95%乙醇液，于40℃、80W重复超声提取15min，以3 000 r/min离心10 min，取上清液；如此重复3次，合并3次上清液。旋转蒸发浓缩后，用95%乙醇溶解定溶于100mL容量瓶中，作为原液备用［8-11］。

取昆仑雪菊黄酮提取物原液0.1mL稀释定容至100 m L，取1m L稀释后的提取液，按标准曲线制备操作步骤于510 nm处测定吸光度值。根据标准曲线计算得到1 g昆仑雪菊提取物中黄酮含量为0.125 g。之后分别采用普鲁士蓝还原法测定KFE和维生素C的还原能力［7］，水杨酸法［12-14］、邻苯三酚自氧化法［12-14］、DPPH法［14］测定KFE和维生素C对羟自由基、超氧阴离子、DPPH自由基清除能力，硫代巴比妥酸法（TBS法）［15］测定KFE和维生素C的脂质体系抗氧化能力。

2 结果

2.1 昆仑雪菊黄酮提取物还原能力的测定采用普鲁士蓝还原法测定样品的还原能力，吸光值越大，说明抗氧化性越好，还原能力越强。由图2可知，昆仑雪菊黄酮提取物和维生素C均具有良好的还原能力，并且其还原能力随着样品浓度的增加而增强，但昆仑雪菊黄酮提取物的还原能力较维生素C弱。

图2 昆仑雪菊黄酮提取物和维生素C的还原能力

2.2 昆仑雪菊黄酮提取物的羟自由基清除能力

由图3可知，昆仑雪菊黄酮提取物具有一定的清除羟自由基的能力。在浓度为100μg/mL左右时，昆仑雪菊黄酮提取物对羟自由基的清除能力略强于维生素C，但随着浓度增加昆仑雪菊黄酮提取物对羟自由基的清除能力逐渐减弱；而维生素C清除羟自由基的能力随浓度升高而显著增强，超过昆仑雪菊黄酮提取物。

图3 昆仑雪菊黄酮提取物和维生素C对羟自由基清除作用

2.3 昆仑雪菊黄酮提取物的超氧阴离子清除能力由图4可知，昆仑雪菊黄酮提取物和维生素C对超氧阴离子的清除作用比较。维生素C对超氧阴离子的清除率随其浓度升高而不断增强，而昆仑雪菊黄酮提取物对超氧阴离子的清除率呈负值，说明昆仑雪菊黄酮提取物可能不具有对超氧阴离子的清除能力。

图4 昆仑雪菊黄酮提取物和维生素C超氧阴离子清除率

2.4 昆仑雪菊黄酮提取物的DPPH自由基清除能力由图5可知，昆仑雪菊黄酮提取物和维生素C都具有较强的清除DPPH自由基能力，对DPPH自由基清除率在80%～100%之间，但是随着样品浓度增加，样品对DPPH自由基清除率增长幅度并不大，昆仑雪菊黄酮提取物对自由基清除能力略低于维生素C。说明浓度对昆仑雪菊黄酮提取物清除DPPH自由基能力影响并不大，不同浓度的昆仑雪菊黄酮提取物均具有较强的清除能力。2.5昆仑雪菊黄酮提取物的脂质体系抗氧化能力由图6可知，昆仑雪菊黄酮提取物具有一定的脂质体系抗氧化能力，当昆仑雪菊黄酮提取物浓度在100～500μg/mL之间，其对脂质过氧化抑制率在20%～30%之间，当浓度达到600μg/mL左右时，其脂质体系抗氧化能力迅速增强。由图6可以看出，维生素C对脂质过氧化抑制率呈现负值，能够说明其对脂质过氧化抑制作用较小。

图5 昆仑雪菊黄酮提取物和维生素C的DPPH自由基清除率

图6 昆仑雪菊黄酮提取物和维生素C对脂质过氧化抑制率

3 讨论

根据反应体系不同，昆仑雪菊黄酮提取物的抗氧化能力不同，总体上看，昆仑雪菊黄酮提取物具有还原能力，清除自由基的能力和脂质体系抗氧化的能力，说明昆仑雪菊黄酮提取物具有较全面的抗氧化活性。

通过普鲁士蓝法对还原能力的测定结果可以知道，昆仑雪菊黄酮提取物还原能力与其浓度大小存在一定的量效关系，随着浓度的升高而增强。说明昆仑雪菊黄酮提取物具有较好的还原能力。

由水杨酸法对羟自由基清除能力的检测结果可以看到，昆仑雪菊黄酮提取物对羟自由基有一定的清除能力，但其清除能力在到达一定的浓度后开始下降，在低浓度时，昆仑雪菊黄酮提取物对羟自由基的清除能力高于维生素C，而在浓度升高到一定程度后，其对羟自由基的清除能力远不如维生素C。说明昆仑雪菊黄酮提取物对羟自由基有一定的清除能力。

由邻苯三酚自氧化法对超氧阴离子清除能力的检测结果可知，维生素C对超氧阴离子有较好的清除作用并随浓度升高而增强，本次试验未检测出昆仑雪菊黄酮提取物对超氧阴离子的清除能力。说明昆仑雪菊黄酮提取物对超氧阴离子的清除能力弱，在较低浓度下不能表现出对超氧阴离子的清除作用。

通过DPPH法检测对DPPH自由基清除能力的结果可知，昆仑雪菊黄酮提取物对DPPH的清除能力随浓度上升的趋势不明显，但总体清除率较高；虽然其清除能力较弱于维生素C，但整体水平较高。说明昆仑雪菊黄酮提取物具有较好的清除DPPH自由基的能力。该结果与曹燕、庞市宾、徐磊等［14］的研究结果一致。

通过硫代巴比妥酸法对脂质体系抗氧化能力的检测可知，昆仑雪菊黄酮提取物具有一定的脂质体系抗氧化能力在较低浓度时，它的抑制率没有显著变化，在到达一定浓度后，其抑制率明显升高；维生素C的抑制率为负值，可能的原因是维生素C的浓度不够高，在李颖畅、孟宪军的研究［15］中用作对比的维生素C浓度在1mg/mL以上才显示出其对脂质体系的抗氧化能力。说明昆仑雪菊黄酮提取物具有脂质体系抗氧化能力，且明显强于同等浓度的维生素C。

本试验的结果说明，昆仑雪菊具有较好的抗氧化活性，为将其作为一种天然抗氧化剂应用于食品、医药等方面提供一定的理论依据。

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Studies on the Antioxidant Activity of Kunlun Snow Chrysanthemum Flavonoid Extracts in Vitro

XU Bin，WANGDan，GEHong-juan，SONGChun-mei
（School of public Health of Jilin Medical college，Jilin 132013，China）

In order to investigate the antioxidantactivity of Kunlun snow chrysanthemum flavonoid extracts（KFE）in vitro，flavonoid extracts of Kunlun snow chrysanthemum was extracted by ultrasonication in 95%ethanol at 40℃for 15min three times.One gram Kunlun snow chrysanthemum powder contained 0.125 g flavonoid.Then，the reduction ability，scavenging rate to hydroxyl radical（·OH），superoxide radicals（O2-）and DPPH，and the inhibition rate to lipid peroxidation of different concentration of KFEwere determined by Prussian Blue，salicylic acidmethod，pyrogallol autoxidationmethod and DPPHmethod.The results showed that the reduction ability of KFEwas increased with increased concentrations，but lower than Vc.Scavenging rate to·OH was 18.72%，which was thebestat the concentration of 110 g/mL.The ability of scavenging superoxide radicalswasweaker.The ability of scavenging DPPH was the bestat the concentration of 110 g/mL，and the scavenging rate was 94.47%.The ability to inhibiting lipid peroxidation was the bestat the concentration of 605 g/mL，and the inhibit ratewas 54.22%.KFE showed antioxidantactivity.

Kunlun Snow Chrysanthemum；Flavonoid；Antioxidant

SONGChun-mei

S11

A

0529-6005（2015）12-0103-04

2015-08-26

吉林省科技厅重点科技攻关项目，抗氧化功能保健食品“长白参莓颗粒”的研究（20140204069YY）

徐斌（1972-），男，副教授，硕士，研究方向为抗氧化及保健食品研究开发，E-mail：xb-jl@163.com

宋春梅，E-mail：1209816131@qq.com