奶牛乳房炎葡萄球菌菌种的鉴定及其m ecA基因与耐药性关系分析

徐 佳，谭笑，张鑫宇，夏晓莉，孙怀昌

（扬州大学兽医学院江苏省重要动物疫病与人兽共患病协同创新中心，江苏扬州225009）

奶牛乳房炎葡萄球菌菌种的鉴定及其m ecA基因与耐药性关系分析

徐 佳，谭笑，张鑫宇，夏晓莉，孙怀昌

（扬州大学兽医学院江苏省重要动物疫病与人兽共患病协同创新中心，江苏扬州225009）

从209份奶牛乳房炎阳性乳样分离葡萄球菌，用PCR扩增Tuf和16S rRNA基因片段，根据序列同源性进行种的鉴定，用PCR检测mecA基因，用标准方法进行药敏试验。结果显示，分离的104株葡萄球菌分为14个种，包括金黄色葡萄球菌和13种凝固酶阴性葡萄球菌，后者主要为阿氏葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌和产色葡萄球菌，不同于国外的研究报道；松鼠葡萄球菌和溶血葡萄球菌的mecA基因检出率高达66.7%，表皮葡萄球菌达42.9%，金黄色葡萄球菌达35.7%，显著高于国内外报道；大部分葡萄球菌的β-内酰胺类抗生素耐药性与mecA基因检测不相符，可能与其他mec基因有关。

奶牛乳房炎；葡萄球菌；mecA基因；耐药性

自1961年以来，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）的流行传播已遍及全球，20世纪90年代普遍流行β-内酰胺类等抗生素耐药MRSA菌株［1］，1996年日本发现万古霉素中度敏感MRSA菌株［2］，2002年美国发现万古霉素耐药MRSA菌株［3］，引起医药界的高度重视［4］。

葡萄球菌是奶牛乳房炎的主要病原菌［5］。自1972年报道牛乳源MRSA以来，相继从多种动物分离到MRSA［6］。早期牛乳源MRSA分离率在2.5%～4.0%之间，但近年来个别奶牛场的分离率高达15.5%［7］。MRSA可通过直接接触传播，而且存在人和动物种间传播的可能性，因此已成为重要的公共卫生隐患［6-8］。本研究对奶牛乳房炎葡萄球菌种类及其mecA基因与耐药性的关系进行检测分析，旨在为MRSA流行控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂甲苯胺蓝-DNA酶琼脂、冻干兔血浆和3%过氧化氢酶试剂，购自青岛海博生物技术有限公司；r Taq DNA Polymerase，购自宝生物工程（大连）有限公司；High Pure PCR Template Preparation Kit和High Pure PCR Product Purification Kit，购自Roche公司；Mueller-Hinton琼脂（MHA）和Mueller-Hinton肉汤（MHB），购自OXOID公司；药敏纸片，购自杭州微生物试剂有限公司；质控金黄色葡萄球菌ATCC25923，购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2 奶样在2012年6月-2014年6月期间，从江苏省某中等规模奶牛场采集隐性乳房炎奶样209份。

1.3 细菌分离鉴定各取奶样100μL涂布5%绵羊血琼脂平板，37℃培养24 h，根据葡萄球菌菌落形态和溶血类型，挑取疑似菌落进行革兰染色镜检，用试管法凝固酶试验、过氧化氢酶试验和耐热核酸酶试验进行进一步鉴定［9］。

1.4 葡萄球菌菌种的鉴定用High Pure PCR Template Preparation Kit提取葡萄球菌DNA，参考文献［10］用PCR扩增Tuf和16S rRNA基因，将PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定，用Blast程序将所获序列与参考株基因序列进行同源性分析，以≥98.0%为临界值进行种的鉴定。

1.5 mec A基因检测参考文献［11］进行，各取5 μL PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.6 葡萄球菌药敏试验按照世界卫生组织推荐的K-B纸片扩散法进行，分别将质控和分离的葡萄球菌涂布MHA平板，将药敏纸片贴于琼脂表面，35℃培养18 h，参照美国临床和实验室标准化协会标准（CLSI2013）判定结果。

2 结果

2.1 葡萄球菌分离鉴定从209份奶样分离到104株葡萄球菌，均为过氧化氢酶试验和Tuf基因检测阳性，29株为耐热核酸酶阳性，27株为凝固酶阳性。2.2葡萄球菌菌种的鉴定根据Tuf基因序列分析结果，将104株葡萄球菌可分为14个种，其中金黄色葡萄球菌28株，阿氏葡萄球菌、松鼠和产色葡萄球菌各12株，木糖和表皮葡萄球菌各7株，模仿和马胃葡萄球各6株，溶血葡萄球菌3株，沃氏葡萄球菌2株，腐生葡萄球菌、琥珀和苍蝇葡萄球菌各1株，6株未能鉴定到种。再根据16S rRNA基因序列，将其中5株鉴定为木糖葡萄球菌，1株为猪葡萄球菌（表1）。

2.3 mecA基因检测率mecA基因阳性葡萄球菌依次为松鼠葡萄球菌（66.7%）、溶血葡萄球菌（66.7%）、表皮葡萄球菌（42.9%）和金黄色葡萄球菌（35.7%）（表1）。

2.4 头孢西丁耐药率对头孢西丁耐药的主要葡萄球菌依次为松鼠葡萄球菌（91.7%）、溶血葡萄球菌（66.7%）、表皮葡萄球菌（57.1%）、模仿葡萄球菌（33.3%）、金黄色葡萄球菌（32.1%）和木糖葡萄球菌（8.3%）（表1）。

表1 奶牛乳房炎葡萄球菌的m ecA基因及头孢西丁耐药性检测

2.5 mecA基因与耐药性的关系在mecA基因阳性葡萄球菌中，8株松鼠葡萄球菌、2株溶血葡萄球菌和3株表皮葡萄球菌均对青霉素和头孢西丁耐药，10株金黄色葡萄球菌对青霉素耐药，其中8株对头孢西丁耐药。在mecA基因阴性葡萄球菌中，对青霉素耐药的依次为松鼠葡萄球菌（100%）、表皮葡萄球菌（100%）、阿氏葡萄球菌（100%）、木糖葡萄球菌（91.7%）、产色葡萄球菌（75.0%）、金黄色葡萄球菌（72.2%）、模仿葡萄球菌（66.7%）和马胃葡萄球菌（33.3%），对头孢西丁耐药的依次为松鼠葡萄球菌（75.0%）、模仿葡萄球菌（33.3%）、表皮葡萄球菌（25.0%）、木糖葡萄球菌（8.3%）和金黄色葡萄球菌（5.6%）（表2）。

3 讨论

3.1 奶牛乳房炎凝固酶阴性葡萄球菌有20多种，过去一直认为是环境性病原菌，但现已成为许多国家奶牛乳房炎的主要病原菌［12］，这与本研究结果相符，73.1%为凝固酶阴性葡萄球菌。国外奶牛乳房炎凝固酶阴性葡萄球菌以产色、模仿、溶血、木糖和表皮葡萄球菌为主［13］，但本研究以阿氏、松鼠、木糖和产色葡萄球菌为主，表皮和模仿葡萄球菌比例较低，溶血葡萄球菌比例更低，可能与不同奶牛场的奶牛饲养管理和环境条件有关。

3.2 葡萄球菌的mecA基因是其耐受β-内酰胺环类抗生素的主要原因［14］。本研究的松鼠、溶血葡萄球菌mecA基因检出率高达66.7%，表皮葡萄球菌高达42.9%，金黄色葡萄球菌高达35.7%，均显著高于国内外研究报道［7］，可能与该奶牛场长期使用青霉素防治乳房炎有关。

3.3 在mecA基因阳性葡萄球菌中，所有松鼠、表皮和溶血葡萄球菌对青霉素和头孢西丁耐药，10株金黄色葡萄球菌对青霉素耐药，其中8株对头孢西丁耐药，表明其β-内酰胺类抗生素耐药性与mecA基因密切相关。在mecA基因阴性葡萄球菌中，仍有很高比例的松鼠、表皮、阿氏、木糖、产色、金黄色和模仿葡萄球菌对青霉素耐药，较高比例的松鼠、模仿、表皮葡萄球菌对头孢西丁耐药，可能与其他mec基因有关。

［1］Maree C L，Daum R S，Boyle-Vavra S，etal.Community-associ⁃ated methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates causing healthcare-associated infections［J］.Emerg Infect Dis，2007，13（2）：236-242.

［2］Hiramatsu K，HanakiH，Ino T，et al.Methicillin-resistant Staph⁃ylococcus aureus clinical strain with reduced vancomycin suscep⁃tibility［J］.JAntimicrob Chemother，1997，40（1）：135-136.

［3］Chang S，Sievert D M，Hageman JC，et al.Infection with vanco⁃mycin-resistant Staphylococcus aureus containing the vanA resis⁃tance gene［J］.N Engl JMed，2003，348（14）：1342-1347.

［4］Gharsa H，Ben Slama K，Lozano C，et al.Prevalence，antibioticresistance，virulence traits and genetic lineage of Staphylococcus aureus in healthy sheepin Tunisia［J］.Vet Microbiol，2012，156（3-4）：367-373.

表2 奶牛乳房炎葡萄球菌mecA基因与耐药性的相关性

［5］Tenhagen B A，Koster G，Wallman J，etal.Prevalence ofmastitis pathogens and their resistance against antimicrobial agents in dairy cows in Brandenburg［J］.Ger J Dairy Sci，2006，89（7）：2542-2551.

［6］姜慧娇，苏艳，韦海娜，等.牛乳源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测与耐药性分析［J］.新疆农业大学学报，2013，36（1）：16-20.

［7］Wang D，Wang Z，Yan Z，et al.Bovine mastitis Staphylococcus aureus：antibiotic susceptibility profile，resistance genesandmo⁃lecular typing of methicillin-resistantand methicillin-sensitive strains in China［J］.InfectGenet Evol，2015，31：9-16.

［8］苏洋.奶牛乳房炎耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测及基因分型［D］.兰州：甘肃农业大学，2013.

［9］东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册［M］，北京：科学出版社，2001.

［10］Hwang SM，Kim M S，Park K U，etal.Tuf gene sequence analy⁃sis has greater discriminatory power than 16S rRNA sequence analysis in identification of clinical isolates of coagulae-negative staphylococci［J］.JClin Microbiol，2011，49（12）：4142-4149.

［11］Strommenger B，Kettlitz C，Werner G，et al.Multiplex PCR Assay for simultaneous detection of nine clinically relevant antibiotic re⁃sistance genes in Staphylococcus aureus［J］.J Clin Microbiol，2003，41（9）：4089-4094.

［12］PyöräläS，Taponen S.Coagulase-negative staphylococci-emerg⁃ingmastitis pathogens［J］.VetMicrobiol，2009，134（1-2）：3-8.

［13］Piessens V，Van Coillie E，Verbis B，etal.Distribution of coagulasenegative Staphylococcus species from milk and environment of dairy cows differs between herds［J］.JDairy Sci，2011，94（6）：2933-2944.［14］Ito T，Hiramatsu K，Tomasz A，et al.Guidelines for reporting novel mecA gene homologues［J］.Antimicrob Agents Chemother，2012，56（10）：4997-4999.

S852.65+3

B

0529-6005（2015）12-0086-02

2015-08-06

江苏省重要动物疫病与人兽共患病协同创新中心和高校优势学科建设工程项目（PAPD）

徐佳（1987-），女，博士生，主要从事微生物学研究，E-mail：kelly_926@126.com

孙怀昌，E-mail：sunh@yzu.edu.cn