牛轮状病毒重组VP7蛋白抗原间接ELISA诊断方法的建立

侯美如，高俊峰，周庆民，侯喜林

（1.黑龙江省兽医科学研究所，黑龙江齐齐哈尔161006；2.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆163319）

牛轮状病毒重组VP7蛋白抗原间接ELISA诊断方法的建立

侯美如1，高俊峰1，周庆民1，侯喜林2

（1.黑龙江省兽医科学研究所，黑龙江齐齐哈尔161006；2.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆163319）

以纯化的原核表达的牛轮状病毒VP7蛋白为包被抗原，建立了检测牛轮状病毒抗体的间接ELISA诊断方法。特异性试验表明，该抗原与其他5种常见牛病病毒（IBRV、BCV、BRSV、ETEC、Cj）的阳性血清无交叉反应，板内和板间重复性试验的变异系数均小于10%；对来自不同牛场的血清样本检测结果显示，该检测方法与病毒中和试验检测结果符合率达87.2%。本试验建立的ELISA诊断方法具有良好的重复性、敏感性和特异性，为BRV的快速诊断、免疫牛群血清抗体监测及轮状病毒流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。

牛轮状病毒；重组VP7蛋白；间接ELISA；诊断

轮状病毒（Rotavirus，RV）为呼肠孤病毒科（Reoviridae）轮状病毒属（Rotavirus），是各种幼龄动物非细菌性腹泻的主要病原之一。于1968年美国Mebus［1］等首次用电镜从犊牛腹泻粪便中分离出牛轮状病毒，命名为NCDV株（Nebraska calf diarrhea Virus，NCDV）。牛轮状病毒可引起动物精神沉郁、水样腹泻、酸中毒以及食欲废绝，多发于15～45日龄犊牛，是引起犊牛腹泻最重要的病原之一，约50%新生犊牛腹泻是因该病毒感染引起［2］，严重影响养牛业的发展。

目前检测牛轮状病毒的方法有RT-PCR、病毒分离鉴定、病毒中和试验等，但因操作复杂、技术要求高、仪器昂贵等因素，而很难在临床大规

模应用。本试验以纯化的原核表达牛轮状病毒VP7蛋白为包被抗原，采用方阵法初步建立检测牛轮状病毒抗体的间接ELISA诊断方法，旨为牛轮状病毒病临床的大规模流行病学及综合防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料病毒、血清及细胞BRV-DQ株分离自黑龙江省大庆地区某奶牛场；试验中所应用的牛轮状病毒阴、阳性血清均由本实验室制备保存；MA104（恒河猴胎肾传代细胞系）由黑龙江八一农垦大学预防兽医学实验室保存。

1.2 试剂辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG的酶标二抗，购自Sigma公司；四甲基联苯胺（TMB），购自Bioshop公司；胰酶、胎牛血清和DMEM液体培养基，购自GIBCO公司；96孔酶标板，购自美国CORNING公司；其他化学试剂为国产分析纯。

1.3 包被抗原抗原为牛轮状病毒DQ株，经克隆、表达所得的包括5个抗原表位在内的BRVVP7融合蛋白（专利申请中）。将重组菌放于37℃振荡培养至OD600nm值为0.6～1.0 h，加入终浓度为1 mmol/L IPTG，37℃诱导4 h，10 000 r/min离心3min收集菌体，用电洗脱方法进行蛋白纯化。

1.4 重组VP7蛋白间接ELISA检测方法的建立

1.4.1 间接ELISA方法工作条件的确立（1）抗原最适包被浓度和血清最佳稀释度的确定：按方阵滴定法［3］，用碳酸盐包被液将纯化后的重组蛋白（2.40mg/mL）依次作1∶600（4.0μg/mL），1∶1 200（2.0μg/mL），1∶2 400（1.0μg/mL），1∶4 800（0.5μg/ mL），1∶9 600（0.25μg/mL）稀释，每孔100μL包被ELISA板，4℃过夜。阳性血清和阴性血清都作1∶100，1∶200，1∶400，1∶800稀释，兔抗牛IgG酶标二抗作1∶5 000稀释，依照间接ELISA程序操作，OD450nm值用酶标仪读取。选取阳性OD450nm值＞1，阴性OD450nm值＜0.2，P/N值最大时的抗原包被浓度和血清稀释倍数为最佳工作浓度；（2）封闭液及封闭时间的选择：用最适抗原浓度37℃包被2 h，封闭液分别选择1%明胶、5%脱脂乳、1%BSA、10%胎牛血清的PBST进行封闭，同时做不封闭对照组，37℃封闭1 h，进行ELISA试验，选择最佳封闭液。用最佳包被抗原浓度、最佳血清稀释度、最佳封闭液进行ELISA试验，分别封闭0.5、1、1.5、2 h，测定其OD450nm值，选取P/N值最大时为最佳封闭时间；（3）血清最适作用时间的确定：用最适抗原浓度37℃包被2 h，以最适封闭液封闭，将阴、阳性血清稀释至最佳浓度，在37℃分别作用0.5、1、1.5、2 h，依照间接ELISA程序操作，测定其OD450nm值，选取P/N值最大时为血清最适作用时间；（4）酶标二抗工作浓度的选择：用最适抗原浓度37℃包被2 h，以最适封闭液封闭，最适稀释度稀释血清，兔抗牛IgG酶标二抗作1∶2 500、1∶5 000、1∶10 000稀释，依照间接ELISA程序操作，测定其OD450nm值，选取P/N值最大时为最佳的酶标二抗工作浓度。

1.4.2 判定临界值的确定运用建立的ELISA方法分别对47份经病毒中和试验为阴性的血清进行检测，测定其OD450nm值，运用统计学分析，计算出47份阴性血清的平均OD450nm值（X）及其标准方差（S），确定该方法的阴阳性临界值（X+3S），即当检测样本OD450nm值≥X+3S时，可判定为阳性，否则为阴性。

1.4.3 特异性试验对本实验室保存的牛呼吸道合胞体（BRSV）、牛冠状病毒（BCV）、牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）以及产肠毒素大肠杆菌（ETEC）、空肠弯曲杆菌（Cj）的阳性血清作为待检样品，同时设BRV标准阴、阳性血清作为对照，每种样品做2个重复，按照间接ELISA方法进行检测，依据标准判定有无交叉反应。

1.4.4 重复性试验在同一块酶标板内及不同酶标板间检测5份不同抗原水平的样本，每份样品重复4孔，按最佳条件进行ELISA检测。计算同一份样品OD450nm值的变异系数（CV），以检验板内、板间检测样品的重复性。

1.4.5 符合性试验运用建立的间接ELISA检测方法与病毒中和试验同时检测78份牛血清样本，将两种检测方法测定的结果进行比较分析，结果一致的血清样本总数占总体样本数的比例为符合率。

2 结果

2.1 BRV VP7-ELISA最佳反应条件的确定结果

通过方阵滴定法确定抗原最佳包被浓度为0.25μg/mL，血清稀释度为1∶100，酶标二抗作1∶5 000稀释，5%脱脂乳于37℃封闭1 h，血清作用时间1.5 h，酶标二抗作用1 h，试验结果最好。

2.2 间接ELISA方法判定临界值的确定经中和试验证实为BRV抗体阴性牛血清47份，运用建立的间接ELISA方法对其进行测定，计算出47份阴性血清的平均OD450nm值（X）为0.09，标准差（S）为0.047，阴性和阳性对照成立的情况下，确定该方法阴阳性临界值（X+3S）为0.231，若血清样本OD450nm值≥0.231时，判为阳性；OD450nm值＜0.231时判为阴性。

2.3 特异性试验由图1可见，BRV VP7蛋白抗原只与BRV阳性血清反应，与其他5种牛病的阳性血清的OD450nm值均小于0.231，无交叉反应性，表明本试验所建立的间接ELISA方法的特异性较高。

2.4 重复性试验（1）板内重复性试验：在同一块酶标板上检测5份不同抗体水平的血清样品，重复性分析结果见表1，其变异系数在2.95%～6.23%之间，变异程度很小，具有较好的重复性；（2）板间重复性试验：同一份血清样品在4块不同板上进行重复性检测，结果见表2，其变异系数在4.72%～7.52%之间，小于10%，说明板间的变异程度很小，具有较好的重复性。

图1 间接ELISA特异性试验

表1 板内重复性试验

表2 板间重复性试验

2.5 符合性试验利用本试验建立的间接ELISA方法与病毒中和试验同时检测78份牛血清，检测结果见表3，所检血清ELISA阳性为47份，阴性31份；中和试验阳性41份，阴性37份。VP7蛋白ELISA方法与病毒中和试验的符合率达87.2%。

表3 重组VP7蛋白ELISA方法与VN试验的比较

3 讨论

轮状病毒可引起人及各种幼畜腹泻，仔猪和犊牛感染尤为普遍，给养殖业带来重大危害，该病的临床表现常与其他细菌病、病毒病相混淆，难以鉴别，能够准确的诊断该病对本病临床防治具有重大意义。

自1971年Engval和Weemen建立ELISA方法，因其操作简便、判断可观、特异性及敏感性强等特点，被广泛用于临床疾病的检测［4］。本试验运用方阵滴定法对ELISA方法进行条件优化，建立一种简便、快捷的牛轮状病毒血清学诊断手段。

牛轮状病毒VP7蛋白为该病毒的外衣壳蛋白，其蛋白含量位居病毒结构蛋白第二位，占轮状病毒蛋白总量的30%，由轮状病毒第9（或7、8，依不同毒株而异）基因节段编码，共326个氨基酸组成，分子量达37 kDa，是轮状病毒的主要中和抗原，决定其G血清型［5］。本试验以重组构建的BRV-VP7蛋白为包被抗原，利于大规模生产的要求，较以病毒为包被抗原的ELISA方法，其生产工艺简单，产出大，减少散毒风险，对环境有好处。适于实验室及基层临床大规模使用，为无特效药治疗的牛轮状病毒提供了一种更为科学合理便捷的诊断方法，对该病的临床防治及科学的免疫预防提供了前提和基础。

本研究确定了牛轮状病毒间接ELISA方法检测的最佳工作条件和判定标准，即抗原最适包被浓度为0.25μg/mL，血清最适稀释度为1∶100，封闭液为5%脱脂奶粉，最佳封闭时间和血清最适作用时间分别为1 h、1.5 h，最佳二抗工作浓度为1∶5 000。血清样本OD450nm值≥0.231时，判为阳性；OD450nm值＜0.231时判为阴性。

变异系数能够衡量资料中各观测值变异程度，反应观测值在单位均值上的离散程度［6］。本方法板内、板间重复试验变异系数均小于10%，表明该方法结果重现性好。与其他5种牛病病毒阳性血清无交叉反应，特异性强。与病毒中和试验符合率达87.2%，准确性良好。本试验建立的牛轮状病毒诊断方法具有重现性好、特异性强、准确度高、操作简单等特点，为该病毒病的ELISA诊断试剂盒的最终组装提供了试验依据和理论基础。

［1］Mebus C A，Unerdahl N R.Further studies on neonatal calf diar⁃rhea virus［J］.Proc Annu Meet US Anim health Assoc，1969，73：97-99.

［2］殷震，刘景华.动物病毒学［M］.2版.北京：科学出版社，1997：562-571.

［3］董华兴，侯喜林，谢金鑫，等.牛传染性鼻气管炎DQ株gD基因表达及其间接ELISA方法的建立［J］.中国兽医杂志，2011，47（2）：3-5.

［4］曹竹婷，杨少华，杨宏军，等.检测牛轮状病毒抗体间接ELISA方法的建立［J］.中国预防兽医学报，2009，31（3）：213-216.

［5］温乐英.轮状病毒蛋白的研究进展［J］.国外医学病毒学分册，1996，3（3）：65-67.

［6］黄柏槐，张郭伟，远立国，等.H3N2亚型犬流感病毒重组HA1蛋白间接ELISA检测方法的建立［J］.中国预防兽医学报.2012，34（9）：711-714.

Development of an indirect ELISA for detection antibodies to bovine rotavirus using recombinant VP7 antigen

HOUMei-ru1，GAO Jun-feng1，ZHOUQing-min1，HOU Xi-lin2
（1.Heilongjiang Institute of Veterinary Science，Qiqihar 161006，China；2.College of Animal Science
and Veterinary Medicine，Heilongjiang BAY1 Agriculture university，Daqing 163319，China）

An indirect ELISA was developed to detect antibody against BRV using the recombinant protein from the epitopes region of VP7 protein.The recombinant VP7 protein antigen showed no cross-reaction with the positive sera of other five diseases（IBRV，BCV，BRSV，ETEC and Cj）.The established method showed 87.2%concordance with neutralization test.Itwas specific and sensitive，and could be used as a simple and rapid approach formonitoring of anti-BRV antibody and epidemiologic survey of BRV.

Bovine rotavirus；recombinant VP7 protein antigen；indirect ELISA；diagnosis

HOU Xi-lin

S852.65+3

A

0529-6005（2015）12-0017-03

2014-07-23

侯美如（1985-），女，硕士，从事奶牛疾病研究，E-mail：houmeiru168@126.com

侯喜林，E-mail：xly-hou@yahoo.com.cn