舒泰麻醉对大鼠各脑区内源性H2S及胱硫醚β-合成酶的影响

唐琦超，邹 晶，李 妍，刘海玉，冯秀晶，李建男，范宏刚

（东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨150030）

舒泰麻醉对大鼠各脑区内源性H2S及胱硫醚β-合成酶的影响

唐琦超，邹 晶，李 妍，刘海玉，冯秀晶，李建男，范宏刚

（东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨150030）

为研究舒泰麻醉对大鼠脑内源性H2S含量及其合成酶CBS的影响，借以探讨内源性硫化氢及其合成酶CBS与麻醉之间的关系。将24只Wistar大鼠随机分为对照组（C组），翻正反射消失组（Z1组）和翻正反射恢复组（Z2组）。各组于相应时间点取脑，使用亚甲蓝染色法和Western Blot检测各脑区内源性H2S含量及CBS蛋白表达量。结果显示，Z1组脑干和海马内H2S含量较C组均显著降低，且脑干和海马内CBS蛋白表达量较C组显著降低，而丘脑内CBS蛋白表达量显著升高（P＜0.05）；Z2组脑干内H2S含量较C组显著降低，而丘脑内CBS蛋白表达量较C组显著升高，且海马内H2S含量与CBS蛋白表达量较其他四个脑区均显著升高（P＜0.05）。综合实验结果表明，舒泰与脑中内源性H2S及CBS的生成具有一定相关性。

舒泰；脑；内源性硫化氢；胱硫醚β-合成酶

舒泰（Zoletil）作为目前临床上常用的犬猫全身麻醉剂，主要由唑拉西泮和替来他明（又名噻环乙胺）组成。舒泰已经被证明可以作用于谷氨酸能神经元和GABA能神经元［1］。谷氨酸作为谷氨酸能神经元的信号分子，由GABA能神经元释放，可通过脱羧基作用生成GABA。硫化氢（H2S）一直都被认为是有毒气体，但近年来研究发现，体内可产生内源性H2S，作为一种气体信号分子，其在生理学和病理生理学中都具有重要意义。H2S发挥作用的分子靶点主要包括蛋白质、酶、转录因子以及膜离子通道。胱硫醚β-合成酶（CBS）是中枢神经系统内生成H2S主要的合成酶。前期实验发现［2］，氯胺酮麻醉大鼠在注射外源性H2S后，其苏醒时间明显加快，表明硫化氢可加快氯胺酮麻醉苏醒。而作为舒泰主要成分之一的替来他明，与氯胺酮为同类药物，其药理特性相似。因此本试验拟通过对舒泰麻醉后大鼠各脑区内内源性H2S含量及其合成酶CBS蛋白表达量的检测，借以探究舒泰麻醉在不同作用时间与CBS蛋白表达量可能存在的相关性并试述其可能的影响机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组试验选取24只雌性Wistar大鼠，购自长春市伊斯实验动物技术有限责任公司，体重200±20 g，试验前一周置于室温清洁环境安静饲养，自由摄食饮水。将大鼠随机分为对照组（C组）和舒泰麻醉组（Z组），其中舒泰麻醉组又被分为两个亚组，即翻正反射消失组（Z1组）和翻正反射恢复组（Z2组），各组均为8只大鼠。

1.2 试验方法

1.2.1 取样C组腹腔注射0.5mL生理盐水；Z组大鼠按50mg/kg体重腹腔注射舒泰50（法国Vir⁃bac公司），使大鼠处于正常麻醉状态，且在麻醉中保证其体温、呼吸、血压、血氧和心率均于安全范围内。其中Z1组和Z2组分别于翻正反射消失和翻正反射恢复后，C组直接断颈取脑。将脑组织置于冰面并分离出大脑、海马、脑干、丘脑及小脑5个脑区。一分为二，一半放入冻存管内，先于液氮中速冻，后转移到-80℃保存。另一半取出待用。

1.2.2 亚甲蓝染色法测定H2S含量将另一半脑组织按质量与体积比为1∶10的比例加入0.01mol/L PBS，于匀浆器内充分研磨后倒入EP管中，离心机中3 000 r/min（4℃）离心10min，取上清液待测。

量取上清液600μL，加入2 mmol/L磷酸钾400μL，使整个体系的总体积为1 mL，随后放入锥形瓶内充分反应，向其中加入0.5mL的1%醋酸锌，氮气在锥形瓶口充盈30 s后石蜡膜进行封口，随后将锥形瓶转移至37℃水浴中摇床90 min，加入50%三氯乙酸500μL使反应终止，37℃水浴60 min后将锥形瓶中的内容物转移到含有3.5 mL dH2O的试管中，加20 mmol/L对苯二胺盐酸盐500μL和30 mmol/L三氯化铁400μL，室温孵育20 min后转移至96孔板，用酶标仪于670 nm处测定吸光度。按照NaHS的标准浓度制作标准曲线，测出溶液中H2S含量。

1.2.3 Western Blot检测各脑区CBS蛋白表达量（1）处理样品：采用RIPA法裂解各脑区并提取脑组织中总蛋白，然后利用BCA法测定总蛋白浓度，按最终浓度为3μg/μL将样品与上样缓冲液混合，煮沸变性，待用；（2）电泳、转膜及封闭：采用SDS-聚丙酰胺凝胶电泳法：配置10%分离胶，5%浓缩胶，每孔上样量均为30μg，使用Bio-Rad电泳仪，采取恒压电泳，先80 V将溴酚蓝跑至分离胶后，提高电压到120 V将溴酚蓝跑到底。采用恒流湿转，用0.45 nm的PVDF膜，电流设定为300mA，转膜时间为60min。转膜完成后用5%脱脂奶粉封闭2 h；（3）一抗和二抗孵育：一抗选取兔抗CBS（Santa Cruz公司）1∶400稀释，鼠抗β-ac⁃tin（北京中杉金桥生物技术有限公司）1∶400稀释，稀释液为5%脱脂奶粉，4℃过夜孵育。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔的二抗（Santa Cruz公司）1∶4 000稀释，辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠的二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）1∶6 000稀释，稀释液为TBST。二抗室温孵育2 h；（4）显影与数据处理：通过增强化学发光法（ECL），于暗室内利用X线胶片获得目的条带影像，经过显影和定影后，将结果扫描进电脑后分析。使用Image J软件计算灰度值，利用SPSS18.0软件统计结果。

2 结果

2.1 各脑区内H2S含量舒泰麻醉大鼠翻正反射消失后，脑干内H2S含量较C组显著降低9.86%，海马内H2S含量较C组显著降低15.74%；翻正反射恢复后，脑干内H2S含量较C组显著降低8.31%，且海马内H2S含量较其他4个脑区均显著增多。

表1 舒泰麻醉对不同脑区内H2S含量的影响（-X±S，n=8）

2.2 各脑区内CBS蛋白表达量如表2和图1所示，使用舒泰大鼠在其翻正反射消失后，脑干和海马内CBS蛋白表达量相较于C组差异显著且分别降低18.03%和34.42%，而丘脑内CBS蛋白表达量显著升高81.94%；待翻正反射恢复后，丘脑内CBS蛋白表达量与C组相比显著升高75%，且海马内CBS蛋白表达量较其他四个脑区显著升高。

3 讨论

内源性硫化氢在体内合成主要通过3条途径，即胱硫醚β-合成酶（CBS）途径，胱硫醚γ-裂解酶（CSE）途径以及3-巯基丙酮酸硫转移酶（3-MST）途径。其中CBS主要分布在大脑、周围神经系统、肝脏和胰腺；CSE以主动脉、肠系膜动脉、门静脉及其他血管组织为主；而3-MST作为近年来被发现的第3种合成H2S的相关酶，主要也分布于大脑内。CBS和CSE主要位于胞质内，而3-MST主要存在于线粒体内［3］。目前对内源性硫化氢的研究大多都集中在其可以增加谷胱甘肽含量从而起到抗氧化应激损伤作用，对心血管损伤的细胞保护作用以及起到松弛平滑肌的作用，但探讨内源性硫化氢与麻醉相关性的研究相对较少。

表2 舒泰麻醉对不同脑区内CBS蛋白表达量在不同作用时间的影响（-X±S，n=8）

图1 舒泰麻醉对不同脑区内CBS蛋白表达的影响

从上述结果中发现，使用舒泰麻醉后不同时刻，大鼠各脑区中内源性H2S含量和CBS蛋白表达量的变化也各不相同。因此有理由认为，舒泰能影响大鼠脑中内源性H2S含量及CBS蛋白表达量的变化。研究发现［1］，舒泰可影响脑内的谷氨酸浓度。谷氨酸是中枢神经系统中最重要的兴奋性神经递质，谷氨酸作为谷氨酸能神经元的信号分子，是GABA的前体，它可以由GABA能神经元释放。存在于大脑皮层和海马锥体细胞发出的下行通路内，可参与神经元之间兴奋性突触传递，而由于缺乏细胞外的代谢途径，谷氨酸被释放到突触间隙后被星形胶质细胞上的谷氨酸转运体所摄取，转化为谷氨酰胺后作为合成谷氨酸和GABA的原料［4-5］。替来他明能够引起大脑皮层抑制性神经递质GABA含量显著升高［6］。H2S可以引起Ca2+进入星形胶质细胞并向周围传播，形成钙波，在神经元和星形胶质细胞之间相互作用，神经元引起周围的星形胶质细胞的激活，从而调节突触活动［7］。因此，从实验结果中海马内源性H2S含量在翻正反射消失时降低而后在翻正反射恢复时升高这一现象，我们可以假设其变化是因为舒泰中的替来他明能引起海马内谷氨酸含量的升高，进而使内源性H2S参与星形胶质细胞内谷氨酸代谢通路的激活，促进GABA生成，从而起到镇静、催眠的作用，而后由于翻正反射恢复，GABA含量逐步降低。因为内源性H2S可能参与了这一反应过程，这也就为海马内其含量先降低后升高提出一个较为合理的解释。但就目前试验结果来看，仍无法对脑干和丘脑内H2S和CBS含量变化的原因提出合理的解释，需进一步试验，用以研究其可能存在的机制。

4 结论

舒泰发挥全麻作用可能与抑制海马、脑干和大脑皮层中H2S及CBS含量有关，脑内内源性H2S及CBS可能参与了舒泰全身麻醉的调控。

［1］Lee Y A，Kim J-I，Lee J-W，etal.Effects of Various Anesthetic Protocols on F-18-Flurodeoxyglucose Uptake into the Brains and Hearts of Normal Miniature Pigs（Sus scrofa domestica）［J］.Jour⁃nal Of the American Association for Laboratory Animal Science，2012，51（2）：246-252.

［2］范宏刚，冯国峰，郭蔚，等.外源性H2S对氯胺酮全麻大鼠麻醉时间、麻醉效果的影响［J］.东北农业大学学报，2013，44（12）：78-83.

［3］Predmore B L，Lefer D J，Gojon G.Hydrogen sulfide in biochem⁃istry and medicine［J］.Antioxidants&redox signaling，2012，17（1）：119-140.

［4］杨晓运，李智，秦绿叶，等.星形胶质细胞和神经元之间谷氨酸-谷氨酰胺的代谢偶联［J］.生理科学进展，2003，34（4）：350-352.

［5］方琦.脑内组胺及H1受体对星形胶质细胞谷氨酸代谢通路的调控作用［D］.杭州：浙江大学，2013.

［6］张燕.噻环乙胺及小型猪复合麻醉剂（XFM）对大鼠不同脑区神经递质含量的影响［D］.哈尔滨：东北农业大学，2010.

［7］Kimura H，Shibuya N，Kimura Y.Hydrogen Sulfide Is a Signaling Molecule and a Cytoprotectant［J］.Antioxidants&redox signaling，2012，17（1）：45-57.

Effect of Zoletil on endogenous hydrogen sulfide and cystathionine β-synthase in rat different encephalic regions

TANGQi-chao，ZOU Jing，LIYan，LIU Hai-yu，FENG Xiu-jing，LIJian-nan，FAN Hong-gang
（College of AnimalMedicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

In order to study the effectof Zoletil on endogenous hydrogen sulfide（H2S）and cystathionineβ-synthase（CBS）in rat different encephalic regions，and explore the correlation among them，24W istar rats were divided random ly into control group（groupC），disappearance of righting reflex（groupZ1）and recovery of righting reflex（groupZ2）.The brain tissues were taken when reaching each time point.The endogenous H2Scontents and CBSprotein expression in differentencephalic regionswere ana⁃lyzed bymethylene blue staining and western blot.The results showed that the H2S contents and CBS protein expression in groupZIwere significantly decreased in brainstem and hippocampus，and the CBSprotein expression was significantly increased in thala⁃mus（P＜0.05）.In groupZ2，the H2S contentswere significantly decreased in brainstem，and CBS protein expression was signifi⁃cantly increased.The H2S contents and CBS protein expression in hippocampuswere significantly increase than those in other en⁃cephalic regions（P＜0.05）.The results indicate that Zoletil is related with the emergence of endogenoushydrogen sulfide and cysta⁃thionineβ-synthase in brain.

Zoletil；brain；endogenous hydrogen sulfide；cystathionineβ-synthase

FAN Hong-gang

S865.1+3

A

0529-6005（2015）12-0100-03

2014-06-18

国家自然科学基金项目（31001092）

唐琦超（1988-），男，硕士生，主要从事动物麻醉研究，E-mail：tang19880205@126.com

范宏刚，E-mail：fanhonggang2002@163.com