山东部分地区猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查

王海丽，何飞，刘承军，徐公义，张高丞

（1.聊城职业技术学院聊城市畜禽疫病诊疗工程技术研究中心，山东聊城252000；2.山东省聊城市动物医院，山东聊城252000；3.聊城华苑牧业有限公司，山东聊城252000）

山东部分地区猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查

王海丽1，何飞2，刘承军2，徐公义1，张高丞3

（1.聊城职业技术学院聊城市畜禽疫病诊疗工程技术研究中心，山东聊城252000；2.山东省聊城市动物医院，山东聊城252000；3.聊城华苑牧业有限公司，山东聊城252000）

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种以妊振母猪严重繁殖障碍，仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的高度传染性疫病。PRRSV对猪肺泡巨噬细胞有严格嗜性，抗原性极易发生变异，最终导致了目前流行的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）变异株的产生。

在生产中，PRRSV感染发病后缺乏特征性病变，容易继发感染其他疾病，隐性感染也成为不可忽视的问题之一，病情的复杂性加大了，在某种程度上会延误疾病的最佳治疗时机，在生猪产业中增加由该病造成的经济损失。尽管国内近年来已普遍针对PRRS进行免疫预防，但各地区感染率依然居高不下。通过收集山东部分猪场PRRS发病猪群的背景资料，利用RT-PCR方法进行诊断，区分典型PRRSV和HP-PRRSV，对数据加以整合分析，为山东部分地区防控PRRS提供科学依据，促进本地区生猪产业的可持续发展。

1 材料与方法

1.1 病料来源与处理2014年1-12月期间，从聊城东昌府区、阳谷、高唐、临清、冠县、莘县、茌平等地的规模猪场，通过现场剖检、养殖场送样的方式，在临床诊断和病理学诊断的基础上，共收集疑似PRRS发病猪群727份组织病料，包括：肺门淋巴结、肺脏、脾脏、肾脏及特征病变明显的部位，用生理盐水冲洗后编号置于-20℃待检。

1.2 试验材料RNA提取TRIZol试剂盒、琼脂糖（Agarose），购自Promega公司；反转录酶MMLV、RNA酶抑制剂、dNTPs、Taq酶、Marker DL-2 000等，购自TaKaRa（大连）宝生物工程有限公司。

1.3 PCR检测引物设计根据GenBank公布的PRRSV JXA1株（GenBank accession no.EF112445）毒基因组的核苷酸序列，应用Primer 5.0软件设计1对针对NSP2高变区的特异引物（见表1），引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 PRRSV序列引物

本引物通过扩增后能区别高致病性PRRSV（680 bp）和经典PRRSV（770 bp），用ddH2O溶解成浓度为20μmol/L，冷冻保存。

1.4 用于提取RNA组织病料的处理取肺脏、脾脏、淋巴结等病料约0.5 g置于研钵中充分研磨，加入1 mL灭菌PBS（DEPC处理），于冰浴中匀浆处理后转移至1.5mL EP管中，-70℃反复冻融3次，8 000 r/min（4℃）离心10min，取上清200μL，按总RNA提取试剂盒操作步骤提取RNA。

1.5 cDNA第一链的合成反转录总体积为10 μL，反应体系为：无Rnase水3.75μL；MgCl22.00 mL；10×RT-Buffer缓冲液1.00μL；dNTPs 1.00 μL；RNA模板1.00μL；随机引物Random Primer 0.50μL；RNA抑制剂RRI 0.25μL；反转录酶MMLV 0.50μL。

混匀后按照反应参数：42℃50 min，99℃5 min，5℃5min，得到的液体既为cDNA模板，可立即进行PCR反应或-20℃下保存备用。

1.6 PRRSV基因的PCR扩增建立用于检测PRRSV的RT-PCR方法。PCR反应总体积为25.00μL，反应体系如下：cDNA产物2.50μL，2×Taq PCRMaster Mix 12.50μL；ddH2O 8.00μL；上游引物NSP2-F和下游引物NSP2-R各1.00μL（20 pmol/μL）。

反应循环参数：94℃预变性6 min；94℃变性1 min、56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环；最后72℃延伸10min。

反应结束后，取5μL PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物，在凝胶成像系统中观察条带，高致病性PRRSV为680 bp、经典PRRSV为770 bp。

2 结果

2.1 不同地区PRRSV感染情况对2014年采自山东部分猪场的727份PRRSV疑似病料进行RTPCR检测，结果共检出PRRSV阳性样品306份，阳性率为42.09%，以高唐、莘县阳性比例较高，分别为55.63%、53.85%，见表2。

2.2 不同时期PRRSV的感染情况2014年1-12月期间，PRRSV阳性率最高的2个月分别为10月（51.02%）、11月（50.00%），PRRSV阳性率最低的2个月分别为：3月阳性率为32.79%、2月阳性率为37.80%，结果见图1。

图1 不同月份PRRSV感染率

2.3 经典PRRSV流行病学调查引物设计中所得样品的电泳条带770 bp既为经典PRRSV。经RT-PCR检测，727份样品中，共计感染经典PRRSV为49例，所占比例为6.74%，山东部分猪场经典PRRSV感染情况：最高地区为阳谷，阳性率为14.66%，其他依次为莘县（12.31%）、临清（9.38%）、高唐（7.14%）和东昌府区（3.83%），冠县、茌平未发现有经典PRRSV感染。经典PRRSV数量在总的阳性数量中的比例从高到低依次为阳谷、莘县、临清、高唐、东昌府区，见表2。

在被检测样品中，不同时间段内，经典PRRSV感染情况具体为2014年1、3、6月份各4例，2、8月份各5例，5、7、10、11月份各3例，4月份7例、12月份2例（见图2）。

2.4 HP-PRRSV流行病学调查从引物设计中所知，如果电泳条带是680 bp，样品就是HP-PRRSV。经RT-PCR检测，727份样品中，共计感染HP-PRRSV为257例，所占比例为35.35%。山东部分猪场HP-PRRSV的感染情况最高的地区为茌平49.25%，其次为高唐49.11%、莘县41.54%、冠县39.77%、临清33.33%、东昌府区29.51%，阳性率最低的为阳谷18.10%（见表2）。

表2 不同地区经典PRRSV感染情况

在被检测样品中，不同时间段内，HP-PRRSV感染数量最多为8月份31例，7月份、12月份均为28例，2月份、7月份为26例，5月份、10月份、11月份为22例，1月份、3月份均为16例，4月份、9月份均为10例。

3 讨论

目前我国PRRSV流行以HP-PRRSV为主要流行毒株，经典毒株和其他变异毒株时有出现，偶有欧洲毒株存在的相关报道。研究表明［1］，NSP2是经历显著遗传变异的PRRSV基因组中突变率最高的部分，又具有很高的耐缺失或插入的能力。此外，由于NSP2的蛋白酶活性，使得NSP2编码区可能在病毒复制和调节宿主免疫方面具有至关重要的作用。因此，NSP2可作为监测PRRSV变异株的独特标记，用于PRRSV的分子流行病学分析［2］。

从调查结果看，PRRS在全年任何季节均可发病，各个阶段的生长猪群均可感染发病［3］。临床调查表明，30日龄内的仔猪发病率和死亡率最高，老疫区的发病有持续性和隐性感染性的特点。这可能与气候突变及寒冷天气引发的应激更易促使机体发病有关，已有大量研究表明，仔猪体内的母源抗体在14日龄时达到最低，30日龄内的仔猪不仅正处于生长发育较快的时期，而且在此阶段由于机体自身的免疫系统还不健全，因此在外界气候环境突变的应激下，自身的抗病力很弱极易感染疾病。由于弱毒活疫苗在选择压的作用下会发生返强突变，从而造成PRRS的暴发［4-5］。

本试验采集的病料大多源于使用PRRSV经典毒株弱毒苗免疫的猪场，但未做具体统计，因此，作者所得PRRSV阳性率是否包含疫苗毒株值得考虑。近年来少部分猪场开始使用HP-PRSSV的致弱苗和灭活苗，但对HP-PRRSV的防制效果均不如使用PRRSV经典苗对经典PRSSV毒株保护效果确实。通过检测发现，猪场使用了PRRSV弱毒苗免疫后，虽然经典株检出率很低，但PRRSV缺失株的检测率较高，说明目前市场的疫苗依然不能很好地控制PRRS的发生，新的PRRSV也在不断出现，其对我国养猪业发展的影响，应当引起高度的关注［6］。

山东部分地区PRRS已成流行趋势，且不分季节，一年四季均能传播感染。经典PRRSV感染率只有6.74%，HP-PRRSV已在鲁西周边地区流行暴发，不过检出率呈下降趋势。通过有效的检测手段对PRRS进行准确、及时的确诊和监测是防控该病的重要环节，建立合理免疫程序、强化生物安全等防控措施，重视疾病诊断、早发现、早防治，防止其他疾病混合感染，会在一定程度降低实际生产中PRRS的感染率、发病率以及病死率，基本控制该病的流行与传播，确保养猪业取得显著的经济效益与社会效益。

［1］Allende R，Kutish G F，Laegreid W，et al.Mutaions in the ge⁃nome of procine reproductive and respiratory syndrome virus re⁃sponsible for the attenuation phenotype［J］.Arch Virol，2000，145：1149-1161.

［2］韦祖樟，孙志，袁世山，等.猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学研究进展［J］.微生物学通报，2008，35（3）：408-413.

［3］刘晓东，何海健，姜正前，等.浙江部分地区猪场猪繁殖与呼吸综合征与副猪嗜血杆菌病流行现状［J］.中国兽医杂志2014，50（5）：53-54.

［4］Opriessing T，Halbur PG，Yoon K J，etal.Comparison ofmolecu⁃lar and biological characte-ristics of amodified live porcine re⁃productive and respiratory syndrome virus（PRRSV）vaccine（in⁃gelvac PRRS MLV），the parent strain of the vaccine（ATCC VR2332），ATCC VR2385，and two recent field isolates of PRRSV［J］.JVirol，2002，76（23）：11837-11844.

［5］Nielsen J，Botner A，Hansen B V，et al.Experimental inoculation of late term pregnant sowswith a field isolate of porcine reproduc⁃tive and respiratory syndrome vaccine-derived virus［J］.Vet Micro⁃biol，2002，84（1/2）：1-13.

［6］周峰，常洪涛，赵军，等.2012-2013年猪繁殖与呼吸综合征病毒河南流行株的分离鉴定及分子流行病学调查［J］.中国兽医学报，2014，34（9）：1398-1404，1410.

S858.28

B

0529-6005（2015）12-0092-03

2015-03-31

山东省高等学校科技计划项目（J14LF56）；聊城职业技术学院重大项目（2015LZYK04）

王海丽（1979-），女，讲师，博士，从事动物微生物及疫病防控研究，E-mail：yzwhl.2008@163.com