入孵种鸭胚病毒性感染的检测及禽坦布苏病毒的分离鉴定

傅光华，危斌勇，陈翠腾，傅秋玲，潘飞龙，程龙飞，陈红梅，万春和，施少华，黄 瑜

（1.福建省农科院畜牧兽医研究所，福建福州350013；2.江西省南城县畜牧水产局，江西南城344700）

入孵种鸭胚病毒性感染的检测及禽坦布苏病毒的分离鉴定

傅光华1，危斌勇2，陈翠腾1，傅秋玲1，潘飞龙2，程龙飞1，陈红梅1，万春和1，施少华1，黄 瑜1

（1.福建省农科院畜牧兽医研究所，福建福州350013；2.江西省南城县畜牧水产局，江西南城344700）

本研究应用RT-PCR技术对孵化过程中死亡的不同品种种鸭胚进行常见病毒感染检测。结果表明，死亡的种鸭胚感染病毒种类多达9种，且首次从鸭胚中检测到禽坦布苏病毒（ATV）感染，不同品种的种鸭胚病毒感染率差异较大，以种番鸭胚感染率最高达58.82%。ATV囊膜蛋白（E）基因分析表明，3株种鸭胚ATV分离毒（PT15-4株、FJFQLL36株和PT15-27株）与GenBank中已发布鸭源ATV囊膜蛋白的核苷酸及氨基酸序列同源性分别在97.2%～99.8%及97.1%～99.4%之间，亲缘关系密切。动物试验表明，3株病毒对开产麻鸭的致病性不尽相同，其中PT15-4株和PT15-27株可引起麻鸭产蛋量显著降低及卵巢的出血病变，而FJFQLL36株病毒对麻鸭产蛋影响不明显，且未引起蛋鸭卵巢明显出血或卵黄液化病变。以上结果表明，我国种鸭胚中病毒性感染较为复杂，而且还出现了ATV的感染，尽管不同禽坦布苏病毒分离株间存在毒力差异，但均可从种鸭经卵传播到种蛋而成为新的传染源。

入孵种鸭胚；病毒性胚胎病；禽坦布苏病毒；垂直传播

我国为世界水禽生产大国，其饲养量占全球总量的75%以上，但并非水禽生产强国，其种鸭场养殖水平、孵化场建设和种蛋孵化水平等均参差不齐，尤其是近些年来孵化场入孵种鸭胚出现死亡的现象有所增多。我们自2011年以来，从福建、江西、广东、广西等省（区）部分种鸭孵化场收集的入孵后不同时候死亡受精种鸭胚，通过照胚剔除蛋内发黑鸭胚，取尿囊液清亮的死亡种蛋胚内容物分别进行了鸭常见病毒的检测，发现受检的五种不同品种种鸭胚其病毒感染的阳性率、感染的病毒谱存在较大差异，其中坦布苏病毒感染在5种不同种鸭胚中均存在。对以鸭胚成纤维细胞分离纯化后鉴定的3株种鸭胚源禽坦布苏病毒进行结构蛋白基因特性和致病性测定，表现出不同的致病性，这提示感染过禽坦布苏病毒的种鸭很可能以垂直传播方式将该病毒传至种蛋中成为新的传染源。现将相关研究及其结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 样品的来源及处理自福建、江西、广东、广西等省（区）部分种鸭孵化场收集入孵后不同时候死亡的受精种鸭胚781枚，通过照胚剔除蛋内发黑鸭胚后最终获得476枚死亡种蛋胚，其中北京鸭种鸭胚109枚、北京樱桃谷种鸭胚163枚、白改鸭种鸭胚73枚、种麻鸭胚80枚、种番鸭胚51枚。用3%碘酊及75%酒精对种鸭胚蛋外壳进行消毒，无菌死亡种蛋胚内容物用于病毒的检测，采集的样品于-80℃条件下冻存备用。

1.2 试剂和试验动物AMV反转录酶和RNase Inhibitor，购自Thermo生物科技有限公司；DNA/ RNA抽提试剂盒、DNA琼脂胶回收试剂盒，购自QIAGEN科技有限公司；DNA聚合酶和pMD18-T载体，购自宝生物工程（大连）有限公司。160日龄产蛋麻鸭，购自福州某蛋鸭养殖场，经检测禽坦布苏病毒血清抗体为阴性。

1.3 病毒感染的检测取适量种鸭胚内容物与2倍体积无菌PBS（pH值7.2）匀浆后冻融3次，离心取上清以DNA/RNA提取试剂盒提取总的核酸，参照已报道的鸭常见病毒检测方法（如禽流感病毒［1］、鸭甲肝病毒、细小病毒、新城疫病毒［2］、鸭坦布苏病毒［3］、鸭呼肠孤病毒［4］、鸭瘟病毒［5］、产蛋下降综合征病毒和圆环病毒等9种病毒）进行检测。

1.4 禽坦布苏病毒的分离及E蛋白基因序列测定随机取6份检测为禽坦布苏病毒单一阳性的样品，反复冻融3次后，于4℃下经8 000 r/min离心30min，取上清接种鸭胚成纤维细胞，观察细胞病变、收集细胞毒，并提取其总RNA，参照［6］报道的方法扩增病毒E蛋白编码基因，送上海生工生物工程技术服务有限公司测定。应用LASER⁃GENE.7.0等分子生物学软件将获得E基因测序结果进行序列编辑、同源性比对及分子系统进化等分析。

1.5 禽坦布苏病毒对产蛋麻鸭致病性测定自福建省山区购进141日龄麻鸭400只，分栏隔离饲养。以自死亡种鸭胚中分离的3株禽坦布苏病毒细胞传代毒分别经腿部肌肉注射160日龄产蛋麻鸭（产蛋率约63%）各50只（即通过摸蛋随机选取已开产蛋鸭31只、未开产19只）、1mL/只，设为A、B组和C组；经肌肉注射1 mL/只无菌生理盐水的50只（同前选鸭）麻鸭为注射应激对照组（D组），另留50只（同前选鸭）麻鸭作为无注射应激的空白对照组（E组）。将5组试验蛋鸭隔离饲养，每天观察2次、连续观察14 d，及时记录其采食量及产蛋情况等临床表现，于攻毒后第7天每组扑杀3只蛋鸭以观察卵巢病变。

2 结果

2.1 死亡种胚蛋中病毒的检测结果运用RTPCR方法，对采集的476份死亡种蛋胚内容物分别进行以上9种病毒的检测。结果显示，这些死亡的种鸭胚病毒感染阳性率为25.63%。检测的9种病毒中，以禽坦布苏病毒的感染阳性率最高，为6.51%，禽流感病毒、禽坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒和鸭圆环病毒等4种病毒在5种种鸭胚中均检测到，而鸭瘟病毒在5种种鸭胚均未检测到。各种种鸭胚的病毒感染阳性率也各不相同，其中种番鸭胚病毒感染阳性率最高（58.82%），而北京种鸭胚病毒阳性率最低，为15.59%。各品种种鸭胚的病毒感染种类和数量的检测情况见表1。

2.2 种鸭胚源禽坦布苏病毒的分离、纯化与鉴定随机取6份检测为禽坦布苏病毒单一阳性的死亡种鸭胚样品，经常规处理后取上清接种鸭胚成纤维细胞，连传3代后分离到5株病毒，随机取其中3株病毒（PT15-27、PT15-4、FJFQLL36）进行蚀斑纯化，至第8代细胞毒时3株病毒的TCID50分别为102.86/0.1 mL、103.2/0.1 mL、103.75/0.1 mL，经特异性RT-PCR鉴定均为禽坦布苏病毒。

2.3 种鸭胚源禽坦布苏病毒E蛋白基因的序列分析对以鸭胚成纤维细胞分离、纯化的3株病毒（PT15-4、PT15-27和FJFQLL36）参照［7］报道的方法成功获得了E蛋白编码基因，测序结果经编辑、拼接后进行同源性及分子遗传进化分析。结果表明，3株病毒的E蛋白编码基因与GenBank中近来从家禽中分离的坦布苏病毒的核苷酸序同源性在97.2%～99.8%之间，氨基酸序列同源性在97.1%～99.4%之间，而与2010年以前的分离毒株Sitiawan病毒核苷酸和氨基酸序列同源性较低。基于E蛋白编码基因序列的系统进化分析表明，本研究分离的3株坦布苏病毒与2010年后分离的不同禽源坦布苏病毒分离株处于同一个大的进化分支中，而MM1775株（蚊虫源）和Sitiawan株（肉鸡源）则构成另外一个进化分支（见图1）。

表1 不同品种种鸭胚蛋中9种病毒感染的检测结果

图1 3株种鸭蛋源禽坦布苏病毒分离株系统进化分析

2.4 种鸭胚源禽坦布苏病毒致病性本次蛋鸭试验注射应激对蛋鸭产蛋率的影响为3.1%（见表2），以分离纯化的3株病毒（PT15-4、PT15-27和FJFQLL36）第8代细胞毒分别感染160 d产蛋麻鸭的A、B、C组中，在观察的14 d内A、B两组蛋鸭的产蛋率与攻毒前相比分别降低45.9%和47.1%，与空白对照E组的产蛋率相比分别降低42.6%和43.8%；C组蛋鸭的产蛋率与攻毒前相比降低12.1%，比空白对照E组的产蛋率降低8.8%（见表2）。于攻毒后第7天，分别从5组蛋鸭中随机扑杀3只观察卵巢（卵泡）病变，结果只有A、B两组蛋鸭卵泡表现明显出血、大部分卵泡卵黄液化。

表2 3株病毒试验感染开产麻鸭产蛋情况（枚）

3 讨论

本研究对2011年以来采集的死亡种鸭胚进行病毒感染检测发现，病毒感染阳性率达到25.63%，其中禽流感病毒、禽坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒和鸭圆环病毒等四种病毒在5种种鸭胚中均有不同程度的感染，感染的阳性率最低的为1.23%、高者达16.25%。有的种鸭胚甚至检测到8种病毒。各种种鸭胚中，以种番鸭胚病毒感染阳性率最高，为58.82%。可见，我国福建、江西、广东、广西等省（区）部分孵化场入孵后死亡的种鸭胚中病毒感染即病毒性胚胎病较为普遍和严重。

禽坦布苏病毒是2010年4月在我国家禽，尤其是种（蛋）鸭中出现的新发病毒，主要引起种（蛋）禽产蛋骤降［3、7-8］。有学者从发生禽坦布苏病毒病鸭场收集的蚊子中分离到该病毒［9］，推测蚊虫在该病毒的传播中很可能发挥重要作用。然而，值得注意的是，在冬春蚊子较少的季节，该病仍在北方饲养的种（蛋）鸭群持续流行［8］，可见该病毒除了蚊虫外还可通过其他的方式在家禽中散播，其传播方式极为复杂。王英等［10］发现1日龄雏鸭也可检测到携带禽坦布苏病毒，且同场其他日龄的肉鸭都有该病毒感染的现象，据此推测禽坦布苏病毒存在垂直传播的可能。赵冬敏等［11］从发病母鹅到雏鹅出生的整个过程中均检测到坦布苏病毒感染，由此推断禽坦布苏病毒可经鹅胚传到下一代。本研究也从入孵后死亡的种鸭胚中检测到禽坦布苏病毒，且种鸭胚感染率很高。尽管麻鸭攻毒试验表明，种鸭胚分离获得的禽坦布苏病毒的毒力存在株间差异，但这些毒株与已报道的鸭源分离株基因序列同源性很高，亲缘关系密切。种鸭胚中的禽坦布苏病毒很可能是由种鸭经卵传播到种蛋而来，这与赵冬敏等报道禽坦布苏病毒可经鹅胚传到下一代的结论相同。因此，对曾感染过禽坦布苏病毒的种（蛋）禽群所产种蛋，应高度重视禽坦布苏病毒感染的监测。

［1］农业部，高致病性禽流感防治技术规范-2007716151735［S］. 2007.

［2］GBT 16550-2008，新城疫诊断技术［S］.2008.

［3］万春和，施少华，黄瑜，等.一种引起种（蛋）鸭产蛋骤降新病毒的分离与初步鉴定［J］.福建农业学报，2010，25（6）：663-666.

［4］许秀梅，苏敬良，黄瑜，等.两株鸭源禽呼肠孤病毒S3基因序列分析［J］.中国兽医杂志，2008，44（1）：12-14.

［5］Plummer pJ，Alefantis T，Kaplan S，et al.Detection of duck en⁃teritis virus by polymerase chain reaction［J］.Avian Disease，1998，42（3）：554-564.

［6］傅光华，陈红梅，黄瑜，等.白羽半番肉鸭坦布苏病毒的分离鉴定及结构蛋白基因分析［J］.福建农业学报，2012，27（10）：1027-1031.

［7］曹贞贞，张存，黄瑜，等.鸭出血性卵巢炎的初步研究［J］.中国兽医杂志，2010，46（12）：3-6.

［8］Su J，Li S，Hu X，et al.Duck Egg-DropSyndrome Caused by BYD Virus，a New Tembusu-related Flavivirus［J］.PLoS One，2011，6（3）：e18106.

［9］Liu P，Lu H，Li S，et al.Genomic and antigenic characterization of the newly emerging Chinese duck egg-dropsyndrome flavivi⁃rus：genomic comparison with Tembusu and Sitiawan viruses［J］.J G Virol，2012，93：2158-2170.

［10］王英，冯艳杰，于建霞，等.警惕鸭黄病毒的垂直传播［C］.中国畜牧兽医学会禽病学分会第十六次学术研讨会，北京：2012.

［11］赵冬敏，黄欣梅，刘宇卓，等.新型黄病毒在种鹅中垂直传播的研究［J］.南方农业学报，2012，43（1）：99-102.

Investigation of viral infection and isolation and identification of avian Tembusu virus in hatching-egg from breeding duck

FU Guang-hua1，WEIBin-yong2，CHEN Cui-teng1，FU Qiu-ling1，PAN Fei-long2，CHENG Long-fei1，CHEN Hong-mei1，WAN Chun-he1，SHIShao-hua1，HUANG Yu1
（1.Institute of AnimalHusbandry and Veterinary Medicine of Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fuzhou 350012，China；2.Animal Husbandry and Fishery Bureau of Nancheng County，Nancheng 344700，China）

We investigated the viral infection in dead hatching-egg of duck using reverse-transcriptase polymerase chain action（RT-PCR）.The results showed thatat leastnine avian viruseswere found in the dead duck embryos，ofwhich avian tembusu virus（ATV）was also detected.The positive rates of viral infection among eggs-specieswere different，and the highest ratewas in hatching-eggs from breeding Muscovy duck（58.82%）.Sequence analysis of envelope gene of three ATV isolates（PT15-4，FJFQLL36 and PT15-27）showed that these viruses shared a high homology of 97.2%to 99.8%and 97.1%to 99.4%with duck-origin ATV in the nucleotide acid and deduced amino acid sequence，respectively.Animal experiment showed that virus strain PT15-4 and PT15-27 could cause severe eggproduction dropand severe pathology in laying duck，while virus strain FJFQLL36 could not cause death and affect the performance of laying ducks.The fact of the ATV-infection in hatching-eggs indicated that the ATV in infected duck m ight have the ability of transovarian transmission andmake the fertile eggs to be a newly virus carrier.

hatching-eggs from breeding duck；viral infection in embryos；avian tembusu virus；transovarian transm ission Corresponding author：HUANG Yu

S834

A

0529-6005（2015）12-0089-03

2015-08-11

现代农业产业技术体系建设专项资金资助（CARS-43）；国家自然科学基金项目（31201936）；福建省优良蛋鸭品种与设施化养殖创新产业化工程项目；福建省农业科学院“双百”行动项目（sbmx1507-3；sbmx1507-2）

傅光华（1977-），男，博士，副研究员，主要从事禽病分子病毒学研究，E-mail：fuyuan163@163.com

黄瑜，E-mail：huangyu_815@163.com