葛根素体内药代动力学研究进展*

葛根素体内药代动力学研究进展*

★姜丽1*严小军1李云2徐国良1*

(1.江西中医药大学中医基础理论分化发展研究中心南昌 330004；2.江西中医药大学体育教学部南昌 330004)

摘要：葛根素具有提高免疫力，增强心肌收缩力，降血压，改善微循环，抗血小板聚集，降血糖等作用，可用于治疗冠心病、心肌梗死、高血压等心血管疾病及突发性耳聋和糖尿病等症。因其毒性小、安全范围广、疗效好，临床应用不断拓展，已成为生产心脑血管疾病的药品或保健品的重要原料药。考虑到葛根素药代动力学研究日渐深入，本文将从样品前处理，检测方法，药物吸收、分布、代谢与排泄(ADME过程)及体内过程影响因素等方面较系统地对葛根素近年来的药代动力学研究作一综述，为葛根素制剂工艺及临床应用提供参考。

关键词：葛根素；药代动力学；样品前处理；检测方法；影响因素

葛根素(Puerarin)于19世纪70年代被成功提取，90年代被批准用于临床[1]。近年来，因其毒性小、疗效好，临床应用非常广泛，如高血压、心绞痛、心肌梗死、冠心病、等心血管疾病，突发性耳聋和糖尿病等症[2]。本课题组成员早在973计划基金项目“基于经典方剂相关的基础研究”中，发现重用葛根配伍组对大鼠降糖效果更好，且推测发挥作用主要为葛根素等异黄酮类成分。为此，本文对葛根素药代动力学相关内容作一简单梳理，为以葛根素为主要效应成分的中药复方药代动力学提供依据。

1生物样品前处理

生物样品直接来源于机体，通过前处理可提高待测样品结果的准确度和精密度；改善组分的可测定性(如成分富集)；提高选择性(如排除杂质干扰)；延长色谱柱使用期限。药代动力学研究中，首要处理的是去除样品中的蛋白质，使结合的药物释放出来，以便于准确地测定药物及其代谢物的总浓度，另一方面，去除蛋白质可减少乳化的形成，保护仪器性能。去除蛋白质方法一般有：(1)生成不溶性盐。应用的试剂主要有酸类(如HClO4、HPO3、Cl3CCOOH、HCOOH等)和重金属盐类(如CuSO4、AgNO3、ZnSO4等)。两者作用原理均为形成不溶性盐而沉淀，前者需pH值小于蛋白质等电点，后者则需满足pH大于蛋白质等电点。沉淀经离心即可得到澄明上清液。(2)盐析和脱水。盐析法中常使用的中性盐有Na2SO4、NaCl等，其亲水性比蛋白质强，高浓度盐与蛋白质胶粒竞争水化膜，降低蛋白质溶解度而析出，使药物及其代谢物释放出来。脱水法常用能与水混溶的有机溶剂如MeOH、CH3CH2OH、ACN等，当它们过量存在时，可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质沉淀，使与蛋白质结合的药物释放出来。(3)组织酶消化法。其中枯草菌溶素常用于水解蛋白，其在偏碱性pH范围内使蛋白质肽键降解，并可使药物析出，且条件温和，避免某些药物在强酸或高温下水解。(4)液-液萃取(Liquid-liquid extraction，LLE)。此法常用于生物样品中待测物质与基质的分离，是应用最多的分离、净化技术。因多数药物亲脂性强，而生物样品中内源性杂质多为强极性物质，利用二者溶解度的不同，达到分离的目的。因而用有机溶剂提取一次即可从大量样品中富集待测物用于分析。(5)固相萃取(Solid-phase extraction，SPE)。采用固体材料如C18作为固定相，利用固定相对液相各组分的分配系数不同，将液相中待分析的组分从各种化合物的混合物中分离出来，避免了溶剂提取时蛋白质沉淀引起的乳化和药物损失。(6)高速离心。此法一般用于血浆蛋白结合实验和血清的分离。

生物样品中葛根素提取常采用有机溶剂沉淀、酸处理法及固相萃取法。

1.1有机溶剂沉淀法包括笔者在内的大多数研究者常通过添加有机溶剂沉淀蛋白，如MeOH[3]、ACN[4]、无水乙醇[5]或95%乙醇[6]，血浆与溶剂的比例多为1∶2～1∶8[3-8]。

1.2酸处理法邓新国等[9]〗对家兔房水中葛根素样品前处理方法如下：家免房水及玻璃体样本中加入等体积0.5 mol/L的HClO4溶液以除去蛋白质，涡漩混匀1min，离心5 min，取上清进样测定。

李妮等[10]首次用HPLC法对健康人、糖尿病肾病病人服用葛根素后体内药动学进行研究。样品处理方法如下：取血清100 μL，加入100μL 6% HClO4，涡旋振荡2 min，895×g离心10 min，取上清进样测定。

潘震宇等[11]采用新型LC/LC-UV系统测定人体或动物血浆中葛根素的药物浓度。血样处理方法如下：300μL血浆样品中加入15% Cl3CCOOH溶液600 μL，涡旋振荡1 min，离心10 min后，取上清进样测定。

1.3有机溶剂-酸处理结合法吴鸿飞等[12]研究了葛根素微乳和混悬液在小鼠体内的药动学性质，并采用HPLC法测定葛根素血药浓度。其血浆处理方法如下：取30μL血浆，加入15μLMeOH，涡旋混合5min后，继加入30 μL 5% HClO4，涡旋2 min后，离心15 min，上清液用氮气吹干，残渣用50μL流动相复溶，取30μL进样测定。

Jeevan K.Prasain等[13]在葛根素大鼠血清中的药动学研究中则采用MeOH-1% CH3COOH处理血清样品，可得到满意的回收率。

1.4固相萃取法王庆庆[14]等用在线固相萃取法结合HPLC-MS，对葛根素在比格犬中的药动学进行了研究，用ACN-MeOH-0.1% HCOOH(体积比为25∶25∶50)以0.2 mL/min进行洗脱。冯怡等[15]采用LC-MS/MS法测定兔血浆中葛根素的浓度，血浆样品中加入内标后采用固相萃取法处理。

2检测方法

葛根素分析检测方法包括高效液相色谱法(HPLC)、高效毛细管电泳法(HPCE)、液质联用分析法(LC-MS)、薄层色谱-紫外分光光度法(TLC-UV)和薄层色谱-荧光分光光度法(TLC-FL)等。

2.1高效液相色谱法目前，葛根素药动学研究定量方法大多数采用HPLC法，如李彧[16]等研究了葛根素和冰片配伍前后的血药浓度及药动学参数的变化情况；陈小新等[17]测定了葛根素自微乳在比格犬体内生物利用度；姚晨等[18]利用微渗析技术，采用HPLC法测定家兔眼内葛根素滴眼液的浓度；高春艳等[19]研究了葛根素和依达拉奉之间的药动学相互影响及冰片对葛根素在大鼠脑中分布的影响。

2.2液质联用法王文艳等[20]采用LC-MS/MS研究了树枝状聚合物PAMAM葛根素复合物在家兔眼内的药代动力学特征，王莹等[21]用LC-MS/MS法测定大鼠血浆中包括葛根素在内的异黄酮和黄酮类成分。

2.3其它方法朱秀媛等[22-23]曾采用TLC-UV和TLC-FL分离测定大鼠体内葛根素浓度，但此方法需血量较大且操作繁琐，灵敏度较低。田景振等[5]采用高效毛细管电泳法(HPCE)对葛根黄酮缓释胶囊在家兔体内药代动力学进行了研究，发现使用磷酸缓冲液(pH=7.4)作流动相测定葛根素，响应低且基线不平，后改用硼酸缓冲液结果较为理想。

3体内过程

3.1葛根素在体内的吸收葛根素治疗心脑血管疾病的疗效已得到充分肯定，但是其水溶性及口服生物利用度低，临床主要以静脉注射为主，静脉注射后体内消除半衰期短，故需频繁或大剂量给药，可能导致严重的不良反应(如溶血、急性肾衰、过敏性休克等)，极大地制约了其应用[25]。因此，促进葛根素口服制剂的吸收成为研究热点之一。陈小新[26-27]等研究了大鼠及比格犬体内葛根素自微乳药动学性质，结果表明，葛根素自微乳在两种动物体内生物利用度均显著提高。

3.2葛根素在体内的分布大鼠、家兔、比格犬及人的药动学实验均表明，葛根素在体内多脏器均有分布且分布较快。静脉注射后，葛根素较多分布于血浆、肾脏及肝脏，其次在睾丸、脾脏、心脏和肌肉亦有分布。在脑中也可测到葛根素，但含量较低，表明葛根素可透过血脑屏障。蛋白结合实验表明，葛根素的血浆蛋白结合率依次为：肝(32.5%)>肾(27.1%)>血浆(24.6%)>肺(15.8%)[22]。

邓新国等[9]腹腔注射葛根素后发现，其能通过血-房水屏障，眼房水和玻璃体均有分布，表明葛根素可经全身给药用于治疗眼部疾病。

杜力军等[6]制备的葛根黄酮灌胃给药30 min后，在小鼠各组织中的药物浓度从高到低分别为肾>肝>脑>心；在大鼠各组织中为肾>脾>心>肝>肺>脑。

在生理状态下，静注金森脑泰注射液15 min后，葛根素在肝脏及肾脏组织中浓度分别占总给药量0.3%和31.7%。随首时间的延长，组织中药物浓度下降很快，30 min后肝中药物浓度仅为总剂量的0.09%，1 h后肾脏内药量占总剂量的3%，说明葛根素主要在肾脏中分布[28]。

3.3葛根素在体内的代谢与排泄 研究表明，葛根素经大鼠肝微粒体代谢，为细胞色素P450酶 (Cytochrome P450 Proteins，CYP)的底物，当葛根素浓度>10 mg/L 时，葛根素的代谢表现出明显的饱和性，并不随浓度的增加而呈线性增加；葛根素的消除速率随CYP浓度增加而增加，呈线性相关[29]。如果葛根素和CYP诱导剂合用后，这些药物将诱导CYP的活性，进而导致葛根素的代谢增强，最终使葛根素血药浓度降低，疗效减弱。从以上结果可看出，大鼠肝CYP参与了葛根素代谢，对葛根素与CYP相关药物相互作用机理的研究，有助于预防和减轻葛根素与其它药物间的不良反应，最大限度地提高药物安全性和有效性，对临床合理用药具有重要意义[30]。

健康人体静注葛根素后[10，23]，主要由肾脏清除，且在体内分布和消除均较快，无蓄积。在糖尿病肾病(DN)早期，葛根素体内代谢无显著改变，但随着肾损伤加重，葛根素体内分布及清除均明显减慢，导致体内药动学过程发生变化。推荐DN进入临床中期，葛根素用量宜小。

4葛根素药动学影响因素

葛根素药代动力学过程受多种因素影响，包括动物的种属及其生理病理状态，药物给药途径、吸收促进剂和药物剂型及配伍等。

4.1实验动物种类及其生理、病理状态 金昔陆等[31]对葛根素在大鼠、家兔和狗的药代动力学参数与体重的相关性进行了研究。结果表明，葛根素在3种动物体内过程不仅存在种属差异，且药代动力学参数与体重呈一定的相关性，如表观分布容积(Vd)、稳态分布容积(Vss)、体内平均滞留时间(MRT)、清除率(CL)、分布半衰期(t1/2α)与体重呈正相关，而速率常数则随体重增加而迅速减少。

禁食12 h小鼠灌胃葛根黄酮后，在15~ 30 min血药浓度达到峰值，如不禁食则达峰时间后移[6]。

比较大鼠脑缺血再灌注组和正常组，药动学参数如浓度-时间曲线下面积(AUC)、Vd、MRT、体内消除时间有较大差异，葛根素在前组大鼠体内为二室模型，在后组大鼠体内为一室模型。病理状态下，大鼠体内的葛根素AUC增加、MRT延长、Vd减小，说明在脑缺血再灌注引起的病理损伤下，葛根素从血浆进入其他组织灌注速度变慢，体内清除时间延长。推测在病理状态下，机体膜转运能力低下造成[32-35]。

4.2给药途径 一般灌胃葛根黄酮后，葛根素在5～15 min即可被检出，0.5～1 h达高峰，之后进入消除相。大鼠灌胃200 mg/kg葛根素后，其消除相半衰期(t1/2β)为1.305 h，分布半衰期(t1/2α)为0.17 h；大鼠静脉注射葛根素，消除半衰期t1/2β为(20±8) min，t1/2α为(24±9)min，表明灌胃葛根黄酮，其分布和消除时间均较静脉注射途径延长[36]。在给药途径上，除了注射和灌胃外，近年来也有研究者通过鼻腔[37]、皮肤[38]和眼部[39]给药。

此外，葛根素的排泄与给药途径密切相关。灌胃给药时，葛根素制剂在大鼠主要排泄途径为粪便[22]，给药24 h后粪便排泄量为总给药量的35.7%，尿液排泄量为1.85%。静脉途径给药时则正好相反[11]，尿液排泄占34%，粪便排泄仅占8.9%。

4.3剂型或复方因素 针对葛根素难溶、口服吸收差而影响其临床疗效，因此，通过剂型改造等手段提高葛根素在体内吸收的程度与速度十分必要。近年来，葛根素研究热点集中在提高生物利用度方面，出现了许多新剂型，如葛根素纳米粒[39]、葛根素固体分散体[40-41]、葛根素磷脂复合物[42]、葛根素脂质体[43-44]、葛根素分子筛复合物[45]，这些研究为葛根剂型改革提供了一些参考。

鲁传华等[38]制备葛根素纳米粒，并测定了其在小鼠体内的生物利用度。结果显示，葛根素纳米粒可提高葛根素口服生物利用度，加快体内的吸收，且达峰时间延长，平均滞留时间增加，绝对生物利用度为50.64%。龚显峰等[40]将葛根素、磷脂与PVP制成固体分散体，比较研究其与原料药在大鼠体内的药动学差异。结果表明，固体分散体相对生物利用度比葛根素原料药增加了2.53倍。

顾一珠等[43]利用薄膜分散-超声法制备了葛根素脂质体并比较其与葛根素水溶液吸收情况，结果表明，脂质体生物利用度提高了68%，说明葛根素制成脂质体后，口服吸收显著提高。邓赟等[44]采用逆相蒸发法制备了葛根素脂质体，并与葛根素滴眼液在家兔泪液中的药代动力学进行比较，结果显示，葛根素脂质体制剂的MRT、AUC分别为葛根素滴眼液的3.89、3.06倍。表明葛根素制成脂质体后，可提高药物在泪液中的浓度及延长其体内滞留时间，进而增加吸收。

配伍对葛根素药代动力学也有影响。研究表明[3]，葛根素单用或与天麻素合并用药时，其体内动力学行为也不完全相同。联合给药后，葛根素在大鼠体内主要药代动力学参数与单独给药比较有显著性差异。无论是灌胃还是静脉注射，CL降低、MRT延长；相对生物利用度提高，尤以灌胃组效果显著。

5研究展望

近年来，葛根素及含有葛根素的复方制剂在药物和保健食品中的应用愈加广泛，其药代动力学研究报道也逐渐增多。因复方中各成分间相互作用进而影响药动学过程，故针对复方药动学研究，应以复方本身为研究对象，并将配伍关系考虑进去，才能得到较为准确的数据。建立中药复方效应成分药动学和药效学同步分析模型(PK-PD)，从两者之间的差异找出量化依据，同时加强生理和病理状态下葛根素在体内的吸收分布和代谢研究，为临床治疗提供用药指导。

参考文献

[1] 王靖，吉民，华维一，等．葛根素研究进展[J]．药学进展，2003，27(2)：70-73．

[2]赵莹莲．葛根素的药理作用及临床应用进展[J]．安徽医药，2010，14(12)：1 377-1 379．

[3]Jiang L, Dai J, Huang Z, et al. Simultaneous determination of gastrodin and puerarin in rat plasma by HPLC and the application to their interaction on pharmacokinetics[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2013,915-916(2): 8-12.

[4]修虹，沈诗景．注射用葛根素在小鼠体内的药动学研究[J]．海峡药学，2010，22(12)：24-27．

[5]田景振，魏凤环．葛根黄酮缓释胶囊家兔体内药代动力学研究[J]．山东中医药大学学报，2003，27(6)：454-456．

[6]杜力军，於兰，常琪，等．新工艺制备的葛根黄酮的药代动力学研究[J]．中药药理与临床1997，13(2)：19-24．

[7]陈晓兰，杜守颖，陆洋，等．不同给药途径通窍散瘀方中葛根素在大鼠体内药动学研究[J]．中国中药杂志，2011，15(17)：2 347-2 349．

[8]王雪莉，苏慧，邢东明，等．微细化工艺制备的葛根微粉抗氧化抗凝血及其体内吸收动力学研究[J]．中国实验方剂学杂志，2005，11(3)：32-34．

[9]邓新国，胡世兴，张清炯，等．葛根素腹腔注射在家兔房水中的药代动力学研究[J]．眼科研究，2003，21(3)：258-260．

[10]李妮，路玫，陈晖，等．葛根素在糖尿病肾病病人中的药动学[J]．中国新药与临床杂志，2002，21(1)：51-53．

[11]潘震宇，肖轶雯，王峰．新型LC/LC-UV系统建立血浆中葛根素含量测定方法[J]．中南药学，2010，8(11)：814-817．

[12]Wu H, Lu C, Zhou A, et al. Enhanced oral bioavailability of puerarin using microemulsion vehicle[J]. Drug Dev Ind Pharm, 2009, 35 (2): 138-144.

[13]J.K. Prasain, N. Peng, E. Acosta, et al. Pharmacokinetic study of puerarin in rat serum by liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Biomed Chrom, 2007,21(4): 410-414.

[14]Wang Q, Li X, Dai S, et al. Quantification of puerarin in lasma by on-line solid-phase extraction column switching liquid chromatography-tandem mass spectrometry and its applications to a pharmacokinetic study[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2008, 863(1):55-63.

[15]冯怡，薛素琴，孙丽．液相色谱-串联质谱法测定兔血浆中葛根素的浓度[J]．广东药学院学报，2007，23(3)：266-268．

[16]李彧, 冯青月, 曾志伟, 等. 中药冰片对葛根素在大鼠体内药动学行为的影响[J]. 福建中医药大学学报, 2014,24(6): 40-42.

[17]陈小新，原素，李耿，等．葛根素自微乳在Beagle犬体内的药代动力学及生物利用度研究[J]．中药材，2011，34(5)：750-753．

[18]姚晨，周绣棣，曲涛，等．微渗析技术研究葛根素滴眼液麻醉家兔眼内药动学[J]．中国中药杂志，2011，36(16)：2 236-2 239．

[19]Gao C, Li X, Li Y, et al. Pharmacokinetic interaction between puerarin and edaravone, and effect of borneol on the brain distribution kinetics of puerarin in rats[J]. J Pharm Pharmacol, 2010, 62(3): 360-367.

[20]Wang WY, Yao C, Shao YF, et al. Determination of puerarin in rabbit aqueous humor by liquid chromatography tandem mass spectrometry using microdialysis sampling after topical administration of puerarin PAMAM dendrimer complex[J]. J Pharm Biomed Anal. 2011, 56(4): 825-829.

[21]王莹，袁瑾，安叡，等．液相色谱-串联质谱法测定大鼠血浆中异黄酮和黄酮类成分[C]. 第九届全国药物和化学异物代谢学术会议论文集，2009：198-202．

[22]朱秀媛，苏成业，李振华，等．葛根有效成分的代谢研究—Ⅲ．葛根素的代谢及其药代动力学分析[J]．药学学报，1979，14(6)：349-355．

[23]金昔陆，朱秀嫒．血浆中葛根素的薄层-紫外光密度扫描测定法及其在家兔的药动学[J]．中国药理学通报，1991，7(6)：421-424．

[24]王健，赵岚峰，王杰，等．高效毛细管电泳简介及其在中药分析中的应用[J]．中成药，1996，18(10)：45-47．

[25]Quan DQ, Xu GX, Wu XG. Studies on preparation and absolute bioavailability of a self-emulsifying system containing puerarin[J]. Chem. Pharm. Bull,2007，55(5), 800-803.

[26]陈小新，原素，李耿，等．葛根素自微乳在 Beagle 犬体内的药代动力学及生物利用度研究[J].中药材,2011, 34(5)∶750-753．

[27]陈小新，赖小平，李耿，等．葛根素自微乳在大鼠体内的药代动力学研究[J]．中成药，2011，33(7)∶220-222．

[28]王莉，邢东明，孙虹，等．金森脑泰注射剂中葛根素在生理及病理状态下大鼠肝肾分布的比较[J]．中国实验方剂学杂志，2002，8(3)：41-43．

[29]崔升淼，赵春顺，高坤，等．大鼠肝微粒体中葛根素的液相色谱-质谱测定法及药物代谢动力学[J]．沈阳药科大学学报，2007， 24 (1)∶32-36．

[30]冉川莲，段俊国，蹇文渊，等．葛根素药代动力学研究进展[J]．中药药理与临床，2012，28(1)：190-194．

[31]金昔陆，朱秀媛．葛根素在三种动物的药代动力学参数与体重的相关性[J]．徐州医学院学报，1991，11(1)：25．

[32]卢弘，邢东明，孙虹，等．CBN中葛根素、人参皂甙Rg1在正常和脑缺血再灌大鼠体内药代动力学比较[J]．哈尔滨商业大学学报(自然科学版)，2001，17(3)：4-7．

[33]炎彬，孙虹，何希辉，等．葛根黄酮及其葛根素在正常和脑缺血再灌注大鼠体内药动学比较[J]．中国药学杂志，2004，39(3)：48-51．

[34]卢弘，邢东明，孙立红，等．CBN中葛根素、人参皂甙Rg1的高效液相色谱测定法及其在脑缺血再灌注大鼠体内的药代动力学[J]．中国药理学通报，2001，17(5)：591-592．

[35]卢弘，邢东明，孙 虹，等．金森脑泰注射剂中葛根素在正常和缺血再灌注模型大鼠体内的药动学研究[J]．中国药学杂志，2002，37(1)：43-46．

[36]宋振玉．中草药现代研究[M]．北京：北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社，1995：290．

[37]郑彩美，卢毅，张彤，等．葛根总黄酮经鼻与口服给药的药代动力学研究[J]．中成药，2009，31(8)∶1 194-1 198.

[38]王丹，石力夫，胡晋红，等． 微透析联用反相高效液相色谱对大鼠皮肤葛根素的药代动力学研究[J]．分析化学研究简报，2008，36(10)∶1 391-1 395．

[39]鲁传华，吴鸿飞，周安，等．葛根素纳米粒在小鼠体内的药动学[J]．中国医院药学杂志，2008，28(23)：1 977-1 980．

[40]龚显峰，李述溪，赵学玲，等．葛根素固体分散体的制备及大鼠体内生物利用度研究[J]．黑龙江医药，2009，22(2)：157-160．

[41]周毅生，贾永艳，申小清，等．葛根素磷脂固体分散体的制备及体外研究[J]．中国药学杂志，2003，38(1)∶42-44．

[42]李颖，潘卫三，陈士林，等．葛根素磷脂复合物的制备及其固体分散体的研究[J]．中国药学杂志，2006， 41(15) ∶1 162-1 167

[43]顾一珠，周文，翟光喜．葛根素脂质体的研制及其大鼠口服吸收[J]．中药材，2007， 30(8)∶970-973．

[44]邓赟，徐金库，李新松．葛根素脂质体滴眼液的制备及其药动学研究[J]．中国中药杂志，2010，35(3)：301-304．

[45]任君刚, 吕春艳, 王立. 葛根素/MCM-41介孔分子筛复合物的制备及其大鼠体内药动学研究[J]. 中国药学杂志, 2014,(4): 316-321.

收稿日期：(2015-04-09)编辑：曾文雪

中图分类号：R285

文献标识码：A

通信作者：徐国良，教授，硕士生导师。研究方向：中药药理及药代动力学。Tel：0791-87118576，E-mail：xuguoliang6606@126.com。

基金项目：第一作者：姜丽，讲师。研究方向：中药药理评价与药代动力学。Tel：15270034170，E-mail：jiangli1009@126.com。