注射用头孢曲松钠动物体内药代动力学和相对生物利用度研究

臧卫军+高颖慧+向志雄+张乐多

摘 要 目的：对比上海新亚药业与罗氏制药生产的两种注射用头孢曲松钠产品（简称为新亚和罗氏芬）在SD大鼠和食蟹猴的药代动力学性质差异。方法：实验动物在静脉注射和肌肉注射后，采用UPLC-MS/MS测定血浆中头孢曲松浓度，通过Kinetica 5.1计算药代动力学参数。结果：静脉注射后，新亚和罗氏芬在SD大鼠体内的AUC0-t分别为483.4±179.5 μg·h/ml、542.4±166.0 μg·h/ml、在食蟹猴体内分别为1 703.6±564.4 μg·h/ml、1 811.7±601.7 μg·h/ml。肌肉注射后，新亚和罗氏芬在SD大鼠体内的AUC0-t分别为412.6±153.4 μg·h/ml、451.7±147.1 μg·h/ml、在食蟹猴体内分别为1 454.9±592.9 μg·h/ml、1 367.3±772.0 μg·h/ml。相对于罗氏芬，新亚在SD大鼠体内静脉和肌肉注射的相对生物利用度分别为（89.1±98.6）%、（91.3±55.4）%、在食蟹猴体内分别为（94.0±9.6）%、（106.4±103.0）%。结论：两种制剂在大鼠和食蟹猴上的药代动力学特点类似，未见显著差异。

关键词 注射用头孢曲松钠 药代动力学 相对生物利用度

中图分类号：R978.11； R969.1 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2016）21-0070-06

Study on the pharmacokinetics of ceftriaxone sodium for injection and its relative bioavailability in SD rat and cynomolgus monkey

ZANG Weijun*， GAO Yinghui， XIANG Zhixiong， ZHANG Leduo（Central Research Institute， Shanghai Pharmaceuticals Holding Co. Ltd.， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Objective： To compare pharmacokinetic properties of two kinds of ceftriaxone sodium which were produced by Shanghai New Asia pharmaceutical and Roche pharmaceuticals （New Asia and Rocephin for short）. Methods： SD rats and cynomolgus monkeys were intravenously or intramuscularly injected with one of the two preparations， respectively. Their concentrations in plasma were determined by UPLC-MS/MS. The pharmacokinetic parameters were calculated by Kinetica 5.1. Results： The areas under the curve （AUC0-t） of New Asia and Rocephin were 483.4±179.5 and 542.4±166.0 μg·h/ml in SD rats and 1 703.6±564.4 and 1 811.7±601.7μg·h/ml in cynomolgus monkeys via intravenous injection and 412.6±153.4 and 451.7±147.1 μg·h/ml in SD rats and 1 454.9±592.9 and 1 367.3±772.0 μg·h/ml in cynomolgus monkeys via intramuscular injection， respectively. The relative bioavailability of New Asia was（89.1±98.6）% and （94.0±9.6）% in SD rat and cynomolgus monkeys via intravenous injection and （91.3±55.4）% and （106.4±103.0）% in SD rat and cynomolgus monkeys via intramuscular injection， respectively. Conclusion： The pharmacokinetic properties of both preparations in SD rats and cynomolgus monkeys are similar and the significant differences are not found.

KEY WORDS ceftriaxone sodium for injection； pharmacokinetic； relative bioavailability

注射用头孢曲松钠属于头孢第三代广谱抗生素，具有广谱、高效、长效及不良反应少等特点，临床常用于控制格兰阴性菌引起的感染[1]。目前国内外有众多企业生产该产品，上海新亚药业为其中之一。本文研发了一种应用UPLC-MS/MS检测头孢曲松钠的方法，它具有高灵敏度、高选择性的特点。运用此方法研究了上海新亚药业产品（简称新亚）和原研企业罗氏制药产品（罗氏芬）在大鼠和食蟹猴体内的药代动力学特性，并进行等效性分析[2-3]，以期为新亚产品的临床应用提供依据。

1 材料和方法

1.1 仪器

API 4000 QTRAP 型串联质谱仪，配有电喷雾离子化源（ESI）以及Analyst 1.5.1数据处理软件（美国Applied Biosystem公司）；Waters Acquity UPLC系统，包括二元输液泵，自动进样器，（美国Waters公司）；Valco 2-Position 型切换阀（美国Valco Instruments公司）。Thermo-X3R离心机（德国Thermo公司）、Eppendorf 热封仪（美国Eppendorf公司）。

1.2 药品与试剂

大鼠药代动力学注射用头孢曲松钠药品（上海新亚药业，批号1411128）；原研药罗氏芬（上海罗氏制药有限公司，批号SH1793）。食蟹猴药代动力学注射用头孢曲松钠药品（上海新亚药业，批号1509138）；原研药罗氏芬（上海罗氏制药有限公司，批号SH1800）。头孢曲松钠标准品（中国药品生物制品检定所，批号130480-200903，含量83.7%）。内标：替硝唑（上海医药合成研究室提供）；甲醇（Merck KGaA，色谱纯）；肝素钠（国药集团化学试剂有限公司，批号20131017）；醋酸铵（德国CNW，色谱纯）；去离子水（由Milli-Q纯水仪制备）。

1.3 实验动物

SD大鼠：24只，雌雄各半，180～200 g，生产许可证号：BK-SCXK（沪）2013-0016，动物合格证号：2008001655333。来源：上海西普尔必凯实验动物有限公司。

食蟹猴：12只，雄性，2～4 kg，生产许可证号：SCXK桂2011-0002，动物合格证号：0002849。来源：广西雄森灵长类实验动物养殖开发有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 溶液配制

1）标准品储备液 精密称取24.75 mg头孢曲松钠标准品，置于1 ml离心管中，加水定容至414 μl，配制成浓度为50 mg/ml的标准品储备液。

2）标准曲线用溶液 取50 mg/ml标准品储备液，用水依次稀释储备液配制成15 000、13 500、5 000、1 500、500、150、50、10、5 μg/ml的系列标准溶液1。取标准系列溶液1各10 μl，加入到190 μl空白血浆中，配制成750，675，250，75，25，7.5，2.5，0.5，0.25 μg/ml的标准曲线样品[4-7]。

3）质控血浆样品 精密称取头孢曲松钠标准品21.94 mg，置于1 ml离心管中，加水定容至367 μl，配制成浓度为50 mg/ml的质控标准品储备液。先用水稀释成12 000、2 250、5 μg/ml的3个溶液，然后各取10 μl加入到190μl空白血浆中，配制成600、112.5、0.25 μg/ml的高、中、低浓度质控血浆样品。

1.4.2 给药剂量和方法

参照罗氏芬产品说明书，将新亚和罗氏芬头孢曲松钠分别配制成：①SD大鼠静脉注射用药液10 mg/ml，给药剂量为100 mg/kg、体积为10 ml/kg；②SD大鼠肌肉注射用药液20 mg/ml，给药剂量为100 mg/kg、体积为5 ml/kg；③食蟹猴静脉注射用药液25mg/ml，给药剂量为50 mg/kg、体积为2 ml/kg；④食蟹猴肌肉注射用药液50 mg/ml，给药剂量为50 mg/kg、体积为1 ml/kg。

1.4.3 实验方案

SD大鼠24只雌雄各半，分为4组，分别为罗氏芬和新亚静脉注射组和肌肉注射组，每组3雌3雄。在给药前，所有动物禁食过夜（10～18 h），给药后4 h给食。分别于给药前和给药后0.03、0.08、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12 h于大鼠眼底静脉丛取血0.4 ml。

健康雄性食蟹猴12只，采用交叉设计，分别静脉或肌肉注射新亚产品及罗氏芬，间隔1周后给药。受试动物在试验日前3～7 d应在试验场所进行适应性饲养。在给药前，所有动物禁食过夜（10～18 h），给药后4 h给食。给药后0.03、0.08、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12 h经股静脉采集血样1.0 ml。

血样采集后加入5 mg/ml肝素钠10 μl抗凝，放置冰上，于4 ℃、4 300×g离心5 min，取血浆至离心管中于-20 ℃保存备用。

1.4.4 血浆样品处理

取血浆样品50 μl，加入200 μl含内标（10 ng/ml替硝唑）的甲醇溶液沉淀蛋白。涡旋10 min，6 000×g离心10 min，取上清用起始流动相稀释10倍后于96孔板中进样分析。

1.4.5 样品测定方法

色谱条件：BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7μm，美国Waters公司）；流动相A为2 mmol/L醋酸铵水溶液，流动相B为甲醇溶液，梯度洗脱程序如下：0→0.5 min 流动相A和B 的比例为95∶5，0.5→1.0 min线性变至5∶95，1.0→2.2 min 维持5∶95，2.2→2.5 min 线性恢复至95∶5，2.5→3 min 保持95∶5。流速0.35 ml/min，进样器温度4 ℃，柱温40 ℃，进样量5 μl。

质谱条件：离子源为电喷雾电离源（Turbo Ionspray，ESI）；源喷射电压为5 500 V；温度为500 ℃；离子源气体1（N2）压力为50 psi；离子源气体2（N2）压力为50 psi；气帘气体（N2）压力为20 psi；碰撞气压力（CAD）为Medium；扫描时间为100 ms；正离子方式检测；扫描方式为多反应监测（MRM），监测离子对m/z 555.2→m/z 396.2（头孢曲松钠），m/z 248.1→m/z 121.0（替硝唑）；头孢曲松钠和替硝唑的去簇电压（DP）分别为60 V和85 V；碰撞能量（CE）分别为19 V和23 V[8-10]。

2 结果

2.1 方法学验证

2.1.1 方法的专属性

分别取6只大鼠和食蟹猴的空白血浆，除不加内标外，按1.4.4项下方法处理并分析，得到空白样品的色谱图；将一定量的头孢曲松钠标准溶液和内标溶液加入上述大鼠和食蟹猴空白血浆中，依同法操作，获得相应的色谱图；同样方法得到大鼠和食蟹猴给药后4 h样品色谱图（图1）。结果表明，大鼠和食蟹猴血浆样品中内源性物质不干扰头孢曲松钠及内标的测定。

2.1.2 线性关系

以待测物浓度为横坐标X （ng/ml），待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标Y，用加权（W =1/X2）最小二乘法进行回归运算，求得大鼠标准曲线回归方程为：Y=0.040 7X+0.0178（r =0.992 7）；食蟹猴标准曲线回归方程为：Y=0.028 9X+0.002 28（r=0.996 5）。根据标准曲线，本法头孢曲松钠的线性范围均为0.25～750 μg/ml，定量下限为0.25 μg/ml。结果表明，2标准曲线回归方程间斜率相差近一倍，原因可能是大鼠与食蟹猴种属间存在一定基质效应。

2.1.3 准确度与精密度

取SD大鼠和食蟹猴质控血浆样品每个浓度各6份，并用随行标准曲线计算测定的质控样品浓度，与配制浓度对照，求得本法的准确度和精密度（表1）。结果表明，它们的RSD均小于12%。

2.2 SD大鼠PK试验结果

在SD大鼠体内静脉或肌肉注射罗氏芬和新亚产品的药时曲线见图2。采用Kinetica 5.1软件非房室方法计算新亚和罗氏芬在大鼠给药后的主要药动学参数：相对生物利用度F =受试药AUC0-t/参比药AUC0-t×100%。采用配对t检验，比较新亚和罗氏芬的头孢曲松钠药动学参数在给药后的差异，Tmax采用非参数检验，其他参数经对数转换后进行检验。

SD大鼠药药动学参数Tmax、Cmax、AUC0-t、AUC0-∞和t1/2在新亚和罗氏芬间无统计学差异（P>0.05，表2）。

2.3 食蟹猴PK试验结果

在食蟹猴体内静脉和肌肉注射罗氏芬或新亚产品的药时曲线见图2。根据Kinetica 5.1软件非房室方法计算新亚和罗氏芬在食蟹猴给药后的主要药动学参数Tmax、Cmax、AUC0～t、AUC0～∞和t1/2在新亚产品和罗氏芬间无统计学差异（P>0.05，表3）。

3 讨论

本研究建立了定量测定SD大鼠及食蟹猴血浆中头孢曲松钠的UPLC-MS/MS方法。分别在ESI源和APCI源下，对头孢曲松钠采用正、负离子两种检测模式进行研究，比较响应信号强度。结果发现，头孢曲松钠在两种离子化源的负离子扫描方式下，不易裂解，加大裂解能量后，虽然可产生碎片离子，但丰度很低而且不稳定，不适合做定量分析。而在正离子模式下，ESI源较APCI源可产生更高的灵敏度和更稳定的碎片。因此本研究选择ESI源，发现在正离子检测模式下质核比为396的离子峰丰度最高，而且稳定，与相关文献报道相符合[11]。

为了提高分析灵敏度，改善峰形并缩短分析时间，分别尝试用甲醇和乙腈作为流动相中的有机相，结果表明添加甲醇可降低背景噪音，提高待测物的响应度；尝试了在水相中加入醋酸铵和甲酸溶液对峰形的影响，发现加入2 mmol/L醋酸铵可以改善峰形，而加入甲酸溶液后峰形变差；故选用2 mmol/L醋酸铵水溶液作为水相，甲醇溶液作为有机相。

在大鼠实验中，将大鼠随机分为两组，采用了配对t检验的方式进行计算，但大鼠之间存在一定的个体差异，因此生物利用度的标准偏差偏大。在食蟹猴实验中，采用交叉实验，有可能是前后两次肌肉注射位置存在差异，导致肌肉群的吸收会存在一定的差异性，因此其最大浓度点的标准偏差偏大。

本方法的专属性好，灵敏度高，符合生物样品的定量分析要求，分析时间仅为3 min，可为快速、准确地测定生物样品中头孢曲松钠的血药浓度提供有意义的参考。研究结果显示，新亚和罗氏芬头孢曲松钠静脉和肌肉注射给药后，在SD大鼠和食蟹猴体内的药代动力学性质接近，药时曲线一致，主要药代动力学参数Tmax、Cmax、AUC0～t、AUC0～∞和t1/2未见显著性差异。相对于罗氏芬，新亚在SD大鼠体内静脉和肌肉注射的相对生物利用度分别为（89.1±98.6）%、（91.3±55.4）%、在食蟹猴体内分别为（94.0±9.6）%、（106.4±103.0）%。两制剂在SD大鼠和食蟹猴体内生物等效。

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