骨髓间充质干细胞治疗肝脏疾病研究进展

姜华综述，高建鹏审校

作者单位：650051昆明市　昆明医科大学附属延安医院消化内科

骨髓间充质干细胞治疗肝脏疾病研究进展

姜华综述，高建鹏审校

作者单位：650051昆明市昆明医科大学附属延安医院消化内科

第一作者：姜华，女，38岁，硕士研究生，主治医师。主要从事消化内科临床工作

【摘要】骨髓间充质干细胞在适当的条件下可以分化为有功能的成熟肝细胞，为治疗终末期肝病提供了新思路。本文综述了骨髓间充质干细胞治疗肝硬化、肝细胞癌和肝衰竭等肝脏疾病的机制、临床应用价值、移植途径等方面的进展，介绍了在实际应用中存在的问题，并展望了该领域的应用前景。

【关键词】骨髓间充质干细胞；肝硬化；肝细胞癌；肝衰竭；治疗进展

目前终末期肝病最有效的治疗手段为肝移植，因为匹配肝源的紧缺以及高昂的费用，而且肝移植后的排斥反应，均严重束缚了肝脏移植开展，使终末期肝病的治疗非常受限，致使很多人在等待肝脏供体和移植后的排斥反应中去[1]。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchyma stem cells，BMSC）是属于中胚层的一类多能干细胞，存在于骨髓中的基质干细胞。自从Friedenstei[2]首次成功地分离、培养出BMSC并证实在一定条件下具有分化为机体多种组织的能力后，随着组织细胞工程技术和基因工程的发展，BMSC的研究备受广泛关注。作为较为原始的细胞，BMSC的免疫原性比较弱。即使是异种、异体移植，BMSC对于宿主也没有明显的排斥反应。研究者们致力于研究BMSC分离和移植等技术，为终末期肝病的治疗带来新的希望。因为BMSC具有取材方便、损伤小、增殖能力强、遗传背景稳定、便于外源基因的转染和表达调控、体外培养和传代能保持正常细胞遗传学特点、抑制炎症反应和免疫调节效应，而且较少涉及伦理道德，因此应用体外易于扩增和保存的BMSC移植治疗肝脏终末期疾病，逐渐引起国内外学者的重视。

1　BMSC在肝硬化中的治疗作用

肝硬化为临床常见的慢性进行性肝病，也是慢性肝病的共同病理结局，病理组织学上有广泛的肝细胞坏死、残存肝细胞结节性再生，结缔组织增生与纤维隔形成，导致肝小叶结构破坏和假小叶形成，肝脏逐渐变形，变硬而发展为肝硬化。临床上以肝功能损害和门脉高压症为主要表现，并有多系统受累，晚期常出现上消化道出血，肝性脑病、继发性感染等并发症。每年因肝病死亡的患者中55%的病因是肝硬化。肝硬化的病理过程是肝纤维化，其特征是以胶原蛋白为主的细胞外基质合成与降解失衡的动态过程，细胞外基质（extracellular matrix，ECM）合成过多，降解减少，堆积增加，是造成肝纤维化的原因，因此，只要减少ECM合成和（或）增加ECM降解，就可以阻断、抑制或逆转肝纤维化。目前的研究现状来看肝纤维化发生的中心环节是肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）的激活并向肌成纤维样细胞（myofibroblasts，MFs）转化，表达α-平滑肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）。当激活HSCs内多条分子信号通路从基因水平上就可以导致肝星状细胞分子生物学特点发生改变从而诱导肝纤维化发生[3，4]。正常情况下，HSCs处于静止状态。当肝脏受到炎症或机械刺激等损伤时，NF、IFN、IL-1等促炎因子能激活HSCs成为α-SMA阳性的MFs[5]。HSCs被激活，其表型由静止型转变为激活型，并转化为MFs，各种致纤维化因素均把HSCs作为最终靶细胞。激活的HSCs一方面通过增生和分泌细胞外基质参与肝纤维化的形成和肝内结构的重建，另一方面通过细胞收缩使肝窦内压升高。所以肝纤维化治疗的重要策略是抑制HSCs激活、增殖与迁移并且诱导凋亡。研究发现，BMSC能抑制HSCs的增殖，促进凋亡，减轻和逆转肝脏纤维化。骨髓间充质干细胞旁分泌肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体通过上调Caspase-3和死亡受体5蛋白的表达可能是促进肝星状细胞的凋亡的机制[6]。也有实验证明通过BMSC旁分泌肝细胞生长因子（HGF）发挥抑制大鼠肝星状细胞增殖，促进凋亡和抑制HSCs内RhoA mRNA和RhoA蛋白表达，可能是BMSC抗肝纤维化作用的分子机制之一。此外，BMSC可以生成具有调节免疫作用的多种细胞因子，减轻和抑制免疫细胞过度增殖及炎性反应，抑制促炎因子，并且促进肝细胞生长素等细胞因子生成和干扰LPS-Toll样受体4固有免疫通路，抑制HSCs活化[7，8]，阻断其向肝内迁移防止肝细胞的凋亡。BMSC还可以分泌一些重要的酶如：MMP-9以起到降解细胞外基质的目的，发挥延缓肝纤维化的作用。BMSC从多方面干预形成肝纤维化。除了以上生成、分泌一些物质抗肝纤维化，BMSC可以通过造血的生长因子诱导将BMSC融合入肝脏，分化为肝样细胞，从而发挥作用。部分学者认为这种现象的发生可能不是分化的结果有可能仅仅是干细胞与宿主细胞直接的融合现象[9]。这一现象发生概率极低，其生物学意义尚需进一步论证。相反，有研究表明BMSC是肝星状细胞和肌成纤维母细胞的来源之一，且I型胶原转录活化，有可能导致或加重肝硬化。甚至可以促进多种肿瘤的生长。

国外临床研究表明，晚期肝病、肝硬化患者可耐受骨髓间充质干细胞治疗，且对肝脏功能的恢复有积极作用[10~12]。Mohsin et al[13]将损伤的肝组织预处理BMSC，移植到肝纤维化小鼠体内，结果发现移植预处理干细胞组小鼠体内的cK8（重组人细胞角蛋白8）、cKl8（重组人细胞角蛋白18）、ALB（白蛋白）等的表达均较与未处理BMSC组相比增加。国内欧阳石等[14]对67例乙肝肝硬化失代偿期患者行自体骨髓干细胞经肝动脉移植至治疗后分别在4、12、24 w检测谷丙转氨酶、总胆红素较治疗前均逐渐降低；白蛋白、胆碱酯酶水平、凝血酶原活动度逐渐回升；患者体力、食欲等临床症状有所改善。

2　BMSC在肝细胞癌中的治疗作用

原发性肝癌通常以肝细胞癌（HCC）多见，而胆管细胞癌少见，HCC恶性度高，常为慢性肝炎患者发展成肝硬化逐渐进展为HCC，导致肝衰竭和全身转移。HCC是人类主要的恶性肿瘤之一，据世界卫生组织（WHO）报告，全世界每年有约100万人死于肝癌。肝癌死亡率很高，我国肝癌发病率居世界之首，肝癌是我国第2位癌症杀手，是全球第3位癌症死因。患者通常早期症状不明显，查出时通常为中晚期，而且进行肝脏手术，化疗和放疗，发生并发症的风险很高。虽然手术是肝癌的首选治疗，然而，部分肝切除和介入因肝功能失代偿成为阻碍。对于接受放射治疗的患者，肝功能显著降低，耐辐射能力本来就有限。肝移植也是治疗终末期肝病的治疗方案，由于其成本高，缺乏供体器官或者免疫排斥反应使其应用于临床困难重重。据统计，仅有30%的患者可以接受包括手术切除和肝移植的治疗。HCC的治疗是难以令人满意的，面临肝癌治疗方案的短缺。研究BMSC开设了在这一领域的新方向。近年来，在临床研究中有关报道BMSC用于HCC治疗，包括对HCC的生长和转移的影响，可以降低和抑制肝癌肺转移率以及死亡率。然而，它们的作用机制尚未完全明了。

应用超顺磁性氧化铁粒子（SPIO）标记BMSC移植肝癌大鼠模型，BMSC移植后1周及2周的肿瘤平均体积明显小于磷酸盐缓冲液（PBS）组移植等量的PBS和对照组，说明BMSC对肝癌细胞的生长有抑制作用，能够延长肝癌大鼠模型的生存期[15]。Abdel Aziz et al[16]通过流式细胞仪检测BMSC与肝癌细胞共培养后，肝癌细胞的凋亡情况，发现BMSC可以增加肝癌细胞的凋亡率。有研究表明IFN-β基因修饰的骨髓间充质干细胞可以有效地通过抑制AKT/FOXO3a途径减少肝癌细胞在体外和体内的增殖[17]。BMSC还可以作为对肿瘤细胞递送治疗剂的新工具。体内实验表明，静脉内（IV）注射人色素上皮衍生因子（PEDF）表达的BMSC显著抑制原发性肝肿瘤生长和肺转移瘤的发展[18]。

3　BMSC在肝衰竭中的治疗作用

肝衰竭是多种因素引起的严重肝脏损害，病理基础是肝细胞的大量坏死导致肝功能的衰竭。当肝脏疾病进展到终末期肝病时，通常累及广泛肝实质细胞，肝组织再生能力下降，造成肝功能失代偿并最终导致肝功能衰竭。导致其合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生严重障碍或失代偿，出现以凝血机制障碍和黄疸、肝性脑病、腹水等为主要表现的一组临床症候群。临床表现为极度乏力，并有明显厌食、腹胀、恶心、呕吐等严重消化道症状[19]。骨髓间充质干细胞移植治疗急慢性肝损伤在动物模型和一些非随机的临床试验中的有效性已被充分证明。在肝衰竭的起始阶段移植hBMSC，通过增殖和分化为肝细胞可能会迅速参与肝脏再生，同时可合成多种生长因子，对肝脏内局部微环境产生营养性旁分泌作用，包括抗炎，从而减少肝细胞凋亡、刺激内源性细胞增殖和血管增生等，有效的治疗肝衰竭。在急性肝衰竭中，分化为肝细胞可能不是主要的治疗作用，在损伤部位炎症因子刺激下，一方面，BMSC凭借向损伤部位趋化的能力，通过血液循环迁移到受损部位参与修复；另一方面，BMSC合成多种生长因子，以及具有可以抑制炎性应答的细胞因子，刺激内源性细胞增殖和血管增生等[20]。有研究表明，BMSC分泌的因子能够逆转急性组织损伤，可能与其上调IL-10水平有关[21]。临床和实验研究表明肝衰竭时胞外高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGBl）显著升高[22，23]，考虑HMGBl可能参与了急性肝衰竭的病理生理过程并发挥了重要作用，HMGBl的分泌被称为晚期炎症介质[24]，较其他促炎细胞因子出现晚、持续时间长。BMSC移植能够降低肝衰竭小鼠血清中HMGBl的水平，通过抑制HMGB1的释放，阻止肝脏炎症反应进一步扩大，从而减轻炎症反应、降低血清ALT/AST水平，使得肝脏组织炎症细胞浸润明显减轻，部分肝小叶保持完整[25]。另外，BMSC移植技术可以使肝脏的功能短暂重建，为等待肝脏移植赢得足够的时间。Ikeda et al[26]用实验证明BMSC能抑制与急性肝损伤的发生发展有着密切的联系的RhoA-ROCK信号转导通路，其信号通路能调节肝细胞的NADPH氧化酶信号转导途径，介导炎症因子生成，诱导并加重肝细胞凋亡[27]。RhoA-ROCK信号通路被抑制剂阻断后，抑制肝脏实质细胞损伤和/或凋亡。

Kharaziha et al[12]将BMSC通过门静脉或外周静脉注入不同病因的肝衰竭患者，监察到患者的终末期肝病积分显著降低，不仅凝血酶原时间缩短，而且血清肌酐、胆红素、白蛋白等肝功指标均得到明显改善。顾劲扬等[28]收集慢性乙型肝炎慢加急性肝功能衰竭患者血清及正常志愿者血清。通过建立猪肝细胞与BMSC最适共培养体系，发现与BMSC共培养的肝细胞可耐受慢加急性肝功能衰竭患者血清的细胞毒性，以及共培养细胞对肝功能衰竭血清的肝功能有支持作用。在一项旨在研究乙肝肝衰竭自体骨髓间充质干细胞（mMSCs）的一个移植后的长期预后的实验中，53例患者接受单一移植自体mMSCs移植的成功率为100%，未出现严重的副作用或并发症，并且2-3周后ALB（白蛋白），TBIL（间接胆红素），以及PT（血浆凝血酶原时间）得到明显改善[29]。

4　骨髓间充质干细胞移植途径

BMSC移植作为一种微侵入、微损伤的治疗方法日渐成熟，在终末期肝病的治疗方面展现出了极高的临床应用价值。但是最佳的移植途径仍存在争议。目前临床可供选择的BMSC移植途径主要有经外周静脉、门静脉、肝动脉、肝内、腹腔注射、直接肝内注射等多种移植途径。临床上，成为常规手段的是经肝动脉移植方法，但经外周静脉移植操作简单，创伤少，死亡率低，可作为首选方法。Cai J[30]等发现使用肝动脉移植途径BMSC在肝脏内含量较之其它实质器官高，而且7天后肝实质内仍有BMSC存在。肝动脉内化疗技术在临床使用成熟。但也有报道通过肝动脉移植治疗失代偿肝硬化患者未能明显改善肝功能，并且可能导致肾病和肝肾综合征，据此认为肝动脉不是BMSC移植治疗终末期肝病的合适途径[31]。何秀华等人建立肝切除大鼠模型，随机分为3组，即肝切除对照组、尾静脉移植组和门静脉移植组。移植途径对BMSC归巢、定植到肝脏有一定影响，门静脉途径优于外周静脉，BMSC移植对肝大部切除大鼠肝功能恢复具有促进作用[32]。Di Bonzo et al[33]研究发现尾静脉注射BMSC后，BMSC在正常或急性肝损伤的小鼠肝内的聚集非常小，而对于慢性肝损伤，肝内的聚集则相对多。据此认为静脉注射BMSC可能更适用于慢性肝损伤。有研究表明局部注射和门静脉输注干细胞治疗终末期肝病可导致长期的门静脉高压和肺栓塞[34]。每种途径都有优缺点，因此临床选择具体途径应根据肝脏疾病的不同阶段、移植时间、移植细胞数量以及细胞作用机制等因素综合考虑。

5　问题与展望

BMSC移植，为肝脏疾病提供了一种新的策略和希望。但在应用于临床中，也存在一些问题。首先，细胞取材后是否需要体外扩增，有利于再生的数量要达到多少为最佳；其次，BMSC移植入人体后，缺乏一个特异性监测指标，而且BMSC同时具有致瘤性和肝纤维化趋势。近些年，有研究表明超顺磁性氧化铁对移植干细胞的活性和示踪取得了较好的效果；最后，BMSC进入人体后可以分化为肝样细胞，怎样提高定向分化成肝细胞的效率，这些分化来的细胞是否可以完全表达肝细胞的所有功能。这些都是今后研究需要解决的根本问题。但是，BMSC是一种具有巨大分化潜能的细胞，在治疗终末期肝病方面有相当发展潜力，并且利用BMSC的归巢性，能为分子靶向的治疗提供好的细胞载体。目前提出将基因修饰治疗和BMSC移植相结合的治疗策略，细胞基因治疗是指将正常基因整合到宿主细胞.再将宿主细胞移植到靶器官，使之分化并表达特定的基因产物，以达到治疗目的技术，两者结合可优势互补。如何趋利避害，提高安全性、有效性、实用性，将BMSC更好的应用于临床，是我们未来研究方向。

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（收稿：2014-09-10）

（本文编辑：张骏飞）

·综述·

Progress in bone marrow mesenchymal stem cells in the treatment of patients with liver diseases%

% Jiang Hua，Gao

Jianpeng. Department of Digestive Diseases，Yan’an Hostipal，Affiliated to Kunming Medical University，Kunming 650051，Yunnan Province，China

【Abstract】Bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）can be differentiated into functional and mature hepatocytes in the proper conditions. The application of BMSCs may provides a new approach for end-stage liver disease. In this review，we summarized the progress in the application of BMSCs for treating patients with liver diseases such as cirrhosis，hepatocellular carcinoma（HCC）and liver failure. We’ll also discuss the transplantation and the existing problems in the practice.

【Key words】Bone marrow mesenchymal stem cells；Cirrhosis；Hepatocellular carcinoma；Liver failure；Transplantation

DOI：10.3969/j.issn.1672-5069.2015.02.032

通讯作者：高建鹏，E-mail: gaojianpengkm@163.com