干细胞移植对扩张型心肌病模型兔心肌胶原及血管影响

徐洁　曹桂秋

[摘 要] 目的：分析骨髓间充质干细胞（Marrow mesenchymal stem cells，MSCs）移植对扩张型心肌病（Dilated cardiomyopathy，DCM）模型兔心肌胶原及血管影响，探讨该方案治疗DCM的可行性。方法：选取60只新西兰大白兔，按照随机数字表法分为正常对照组、模型对照组、模型移植组，各20只，正常对照组不接受特殊处理，模型对照组、模型移植组均建立兔DCM模型，模型移植组接受MSCs处理。评价三组心功能变化，并比较其移植治疗4周后心肌胶原及心肌微血管密度（MVD）差异，总结MSCs移植的作用效果与机理。结果：移植治疗4周后，正常对照组、模型移植组实验兔均存活，模型对照组实验兔存活率为70.00%，低于其他两组；与造模前相比，模型对照组、模型移植组移植治疗4周后LVEDD、LVESD均升高，LVEF均下降，模型对照组变化更为明显，差异有统计学意义（P<0.05）。移植治疗4周后，模型移植组MVD高于正常对照组，模型对照组MVD低于正常对照组；模型对照组心肌Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及其比值均高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05），模型移植组上述指标与正常对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论：MSCs移植能够抑制DCM模型实验兔心功能恶化进程，其作用机理与提高心肌胶原水平、促进心肌微血管生成有关。

[关键词] 骨髓间充质干细胞；移植；扩张型心肌病；心肌胶原；微血管密度

中图分类号：R394 文献标识码：A 文章编号：2095-5200（2016）06-009-03

DOI：10.11876/mimt201606004

扩张型心肌病（Dilated cardiomyopathy，DCM）预后差 [1]。药物治疗对于DCM患者临床症状的控制具有一定作用，但仅可延缓严重心力衰竭发生时间，无法逆转心室扩张进程 [2]。行心脏移植供体较为缺乏，加之排斥反应、价格昂贵、术后并发症发生风险高等弊端，均限制了心脏移植的临床应用。近年来，大量学者开始关注骨髓间充质干细胞（Marrow mesenchymal stem cells，MSCs）移植治疗DCM的可行性，MSCs具有高度扩增、多向分化潜能[3]，本研究分析实验兔模型，探讨MSCs移植治疗DCM机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

普通级新西兰大白兔60只，雌雄不拘，月龄3个月，体质量（2.26±0.37）kg，均由浙江大学实验动物中心提供，按照随机数字表法将其分为正常对照组、模型对照组、模型移植组，各20只。

1.2 试剂与仪器

主要试剂：盐酸阿霉素粉针剂（深圳万乐药业股份有限公司）；羊抗兔Ⅰ、Ⅲ型胶原抗体（上海瑞齐生物科技有限公司）；免疫组化EliVisionTMplus广谱试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）。

主要仪器：iE-33多普勒彩色超声诊断仪（荷兰飞利浦公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 分组及造模 60只实验兔均在相同条件下饲养，模型对照组、模型移植组均建立兔DCM模型，耳缘静脉注射2 mg/kg盐酸多柔比星（阿霉素），每周1次，持续8周[4]。每周记录实验兔体质量，观察其毛色、运动量、进食量及腹水等状态。模型移植组接受MSCs处理。

1.3.2 MSCs移植 造模8周后，抽取兔股骨骨髓4 mL，参照文献方法实施MSCs分离纯化、培养、鉴定[5-6]。

将MSCs用0.25%的胰蛋白酶消化、吹打形成单细胞悬液，低速离心收集细胞，将浓度为106的MSCs装入微量注射器准备移植。取模型移植组兔，于左心室游离壁分5点注入制备好的骨髓干细胞悬液，每点约30～50 μL，深度4 mm，共1.0×108 个细胞。注射位置以6/0丝线作标记。注射器与心脏呈30℃进针，注射前回抽，防止细胞注入心腔。注射过程中需密切注意实验兔心率、呼吸，防止心律失常和急性左心衰的发生，模型对照组按同样方式于对应时间点注入等量DMEM 培养液[7]。检查无活动性出血后逐层关胸。胸穿抽出胸腔气体，使左肺复张。

1.3.3 观察指标 记录各组实验兔造模成功后（移植治疗后）生存率，并分别于造模前、于移植治疗4周后，对三组实验兔心功能进行检测，检测指标包括左室收缩末期内径（LVEDD）、左室舒张末期内径（LVESD）及左室射血分数（LVEF）；于模型移植组移植治疗4周后同时处死各组实验兔，取其左心室心肌组织，参照文献方法检测其心肌微血管密度（MVD）及心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原平均光密度值[8-9]。

1.4 统计学分析

SPSS20.0统计软件，计数资料以（n/%）表示，并采用χ2检验，计量资料以（x±s）表示，三组间比较采用F检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生存情况

移植治疗4周后正常对照组、模型移植组实验兔均存活，模型对照组实验兔存活率为70.00%，低于其他两组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 心功能变化

移植治疗4周后模型对照组、模型移植组LVEDD、LVESD均较造模前升高，LVEF均下降，模型对照组变化更为明显，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 微血管密度及心肌胶原

正常对照组、模型对照组、模型移植组MVD分别为（26.27±4.39）、（14.36±4.42）、（39.05±5.87），模型移植组MVD高于正常对照组，模型对照组MVD低于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。

移植治疗4周后模型对照组心肌Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及其比值均高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05），模型移植组上述指标与正常对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

3 讨论

DCM病理改变以心肌细胞数量减少与功能减退为主要病理改变，当心肌细胞数量减少到一定程度所致残存心肌细胞代偿功能受损时，心脏泵血功能难以有效维持，即可导致心力衰竭等严重症状，威胁患者生存 [10]。近年来，干细胞移植治疗心血管疾病文献报道增多[11-12]。

本研究采取经典耳缘静脉注射阿霉素的方法建立兔DCM模型，就干细胞移植的治疗效果及机制进行探讨。

可以发现，与造模前相比，移植治疗4周后模型对照组、模型移植组LVEDD、LVESD均呈现上升趋势且LVEF明显下降，符合DCM的临床表现[13]，而模型对照组心功能变化更为明显，说明MSCs移植在延缓心功能恶化方面发挥了积极作用，与Zhang等[14]大鼠DCM模型实验结果一致。

为进一步明确MSCs移植治疗DCM的机理，本研究对实验兔左室心肌胶原及血管状态变化进行了检测，结果表明，移植治疗4周后模型对照组心肌Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及其比值明显升高，而既往研究表明，心肌Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的升高可体现肾素-血管紧张素-醛固酮系统过度活化，这一病理生理改变所致心肌细胞凋亡是造成左室重构加剧、心力衰竭发生发展的主要原因[15]。

与此同时，模型移植组心肌Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及其比值与正常对照组比较，差异无统计学意义，考虑与MSCs移植后，心肌胶原mRNA稳定性增加、胶原纤维降解减少有关，这一机制能够有效抑制心肌及间质细胞增生，延缓心肌肥大与纤维化进程，降低心肌重塑风险[16]。

在MVD的观察中可以发现，移植治疗4周后DCM模型兔心肌MVD明显下降，说明心肌细胞的大量丢失与功能受损可影响血管新生能力，加之纤维化、再生功能及各类生长因子生成障碍，共同造成DCM病程进展[17]。而MSCs移植能够补充丢失的心肌细胞，促进生长因子分泌、改善血管内皮功能，从而改善心肌内微循环障碍状态，达到恢复心功能的目的。Lin等[18]发现，MSCs还可与血管内皮生长因子2受体发挥交联作用，在发挥促血管生成作用的同时，还具有保护心肌、抗凋亡、促细胞分裂、抗纤维化等多种效应，有望推广于其他缺血性疾病的治疗。

综上所述，MSCs移植能够降低DCM模型兔心肌胶原水平、上调MVD，对于局部心肌血流的恢复与心功能的改善具有积极意义，为DCM临床治疗策略的选择提供了新的方向，值得进一步探索。

参 考 文 献

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