聚醚醚酮种植材料TiO2颗粒喷砂处理的生物活性研究

吴晓绵，胡小蕾，邓 锋

（1.重庆医科大学口腔医学院/口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室/重庆市高校市级口腔生物医学工程重点实验室，重庆401147；2.重庆医科大学附属口腔医院正畸科，重庆400015；3.重庆医科大学检验医学院临床检验诊断学重点实验室，重庆400016）

聚醚醚酮种植材料TiO2颗粒喷砂处理的生物活性研究

吴晓绵1，2，胡小蕾3，邓 锋1，2

（1.重庆医科大学口腔医学院/口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室/重庆市高校市级口腔生物医学工程重点实验室，重庆401147；2.重庆医科大学附属口腔医院正畸科，重庆400015；3.重庆医科大学检验医学院临床检验诊断学重点实验室，重庆400016）

目的探讨TiO2颗粒喷砂处理聚醚醚酮（PEEK）的最佳粒度范围。方法用5种粒度范围的TiO2颗粒（A～E组）对PEEK进行喷砂处理，进行表面粗糙度检测，观察细胞黏附、细胞增殖、细胞形貌，并检测碱性磷酸酶（ALP）活性。结果PEEK的表面粗糙度随着喷砂TiO2颗粒的粒度增大而增加。同时发现了多个峰值的存在，细胞黏附实验OD值的峰值出现在C组（180～212 μm TiO2颗粒进行喷砂），数值为0.566 2。经过14 d培养，成骨细胞ALP活性峰值出现在D组（＞212～355 μm TiO2颗粒进行喷砂）。结论PEEK表面喷砂的最佳TiO2颗粒粒度范围为180～355 μm，可为今后PEEK表面改性研究提供重要参考。

骨和骨组织； 生物力学； 生物相容性材料； 碱性磷酸酶； 二氧化钛； 聚醚醚酮

经过长期的临床检验和分析，发现钛和钛合金存在离子析出，并且与骨组织力学性能不匹配，这成为种植体周围无菌性骨吸收和种植体失败的主要原因[1-2]。与金属和其他高分子种植体相比，聚醚醚酮（polyetheretherketone，PEEK）与骨组织力学性能更加匹配[1，3]。PEEK被认为是金属种植体最重要的替代材料之一，然而PEEK的生物惰性限制了它的生物学应用[3]。表面粗糙度被认为是生物材料生物活性最重要的参数之一[4]。多种方法被用于金属种植体表面的改性，喷砂处理是其中被广泛应用的一种[1-3]。TiO2具有优越的生物活性和稳定性。有报道证实，对钛种植体在骨皮质内稳定最好的TiO2喷砂颗粒的粒度范围是180～212 μm[5]。作者对PEEK进行TiO2颗粒喷砂处理表面改性的最佳粒度范围进行了研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 试剂与材料 根据前期研究利用Al2O3对PEEK复合物喷砂处理的实验结果[6]，以及利用TiO2颗粒对钛表面进行喷砂的最佳粒度范围（180～212 μm）[5]，将本研究进行喷砂处理的TiO2颗粒分成A、B、C、D、E五组，颗粒分别为：75～96，＞96～109，180～212，＞212～355，＞355～500 μm（图1）。PEEK粉末从Victrex（UK）获得。成骨细胞系MG 63从ATCC（American type culture collection）获得，培养于含双抗的MEM培养基中。扫描电镜型号为日本HitachiS-4800，喷金机为英国Quorum 550X，机械形貌仪为美国Dektek8 Stylus Profiler，Veeco。WST-1购于德国RocheDiagnostics，碱性磷酸酶试剂盒购于BioChain，蛋白浓度试剂盒购于美国Sigma。

1.2 方法 PEEK粉末在华东理工大学教育部医用生物材料工程研究中心采用压缩成型法进行样品制备。样品被切割成圆片状（Ф 15 mm×2 mm）进行表征和体外实验。样品打磨到2000号进行表面均一化，用机械形貌仪检测的Ra值和Rg值。粗糙度Ra在0.1 μm以下的样品被收集起来。进行喷砂的时候圆盘到喷嘴的距离为10 mm，TiO2颗粒流击打圆盘样品表面的角度为90°，而气流的压力设定为0.5 MPa。在经过喷砂过后，样品用超声清洁仪器在去离子水中进行清洁。样品再用表面形貌仪进行检测粗糙度。

图1 制备的不同粒径的喷砂用TiO2颗粒

在24孔板中，在具有不同粗糙度PEEK表面，以1 ×105/孔的最终细胞浓度进行培养，经过4 h培养后，移除细胞培养液，用PBS冲洗PEEK样品3次以去除没有黏附的细胞，用WST-1的MEM培养基检测黏附细胞的活力。成骨细胞MG63被种在PEEK的圆片上，在经过不同的培养时间（3、7、14 d后），用含有4%戊二醛固定，乙醇梯度脱水，烘箱中干燥，喷金机对样品进行喷金，再用扫面电镜进行细胞形貌观察。将成骨细胞培养在PEEK表面，分别在培养3、7、14 d后用含WST-1的MEM培养液检测细胞增殖活性。经过14 d的培养后，用Triton X-100裂解细胞，再用碱性磷酸酶（ALP）试剂盒检测成ALP活性，并用蛋白浓度试剂盒检测总蛋白作为参比。

1.3 统计学处理 所有的数据利用OriginPro 8 SR3统计软件（OriginLab Corporation，Northampton，MA），计量资料以±s表示；数据采用方差分析进行统计分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PEEK表面粗糙度 随着颗粒TiO2粒度的增大而增加，见表1。Ra值从A组的（1.20±0.15）μm增长到E组的（3.15±0.47）μm，而Rq值从A组的（1.50±0.15）μm增长到E组的（3.96±0.69）μm。

2.2 细胞黏附 经过4 h培养，OD值从A组（0.496 2± 0.046 9）增加到C组（0.566 2±0.020 7），再从C组减少到E组（0.497 8±0.044 2）（图2），在C组存在一个OD峰值，而且C组OD值与A、B、E组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 细胞形貌观察 培养3、7、14 d后，细胞固定，并用SEM观察（图3）。经过3 d培养，成骨细胞MG 63在C组显得更加紧贴PEEK表面，看起来更加平坦。而在E组的成骨细胞显得更加成梭形。

表1 经过喷砂后5种样品的表面粗糙度（±s，μm）

表1 经过喷砂后5种样品的表面粗糙度（±s，μm）

组别A组B组Ra Rq C组 D组E组1.20±0.15 1.50±0.15 2.40±0.56 2.70±0.59 3.15±0.47 1.50±0.15 1.92±0.24 2.94±0.68 3.41±0.87 3.96±0.69

图2 5种PEEK材料的细胞黏附能力检测

图3 经过3、7、14 d培养后的成骨细胞在5种PEEK表面的细胞形貌

2.4 细胞增殖活性检测 在具有不同粗糙度的PEEK表面，经过3 d的短期培养，细胞的增殖和活性差异无统计学意义（P＞0.05）。但是经过7 d的长期培养，C组（PEEK圆盘状样品用180～212 μm粒度的TiO2进行喷砂处理）的成骨细胞WST-1检测的OD值明显强于B组（PEEK圆盘状样品用96～109 μm粒度的TiO2颗粒进行喷砂）（P＜0.05）。经过14 d培养，五组的OD值均随着TiO2颗粒的粒度增加而增加（P＜0.05）。见图4。

图4 经过3、7、14 d培养后的成骨细胞MG63细胞增殖情况

2.5 ALP活性 经过14 d培养，ALP活性随着TiO2颗粒的增加而增加（图5）。从A组增加到D组，E组则较D组下降。在D组存在着峰值。

图5 经过14 d培养后的成骨细胞ALP活性检测

3 讨 论

尽管大量研究报道了PEEK复合材料表面粗糙度能够增强PEEK复合物的生物活性，但是TiO2喷砂处理对PEEK骨结合的最佳粒度范围不明确[6]。本研究的目的是找出TiO2颗粒的最佳范围，为后续研究提供理论依据。经过喷砂处理过后PEEK的表面粗糙度随着TiO2颗粒的粒度增大而增加（表1）。经过在具有不同粗糙度的PEEK表面培养4 h，成骨细胞在C组（由180～212 μm TiO2颗粒进行喷砂处理）培养细胞黏附能力显著增高（图2）。经过7 d的培养，在C组的成骨细胞增殖活性显著增强（图4）。经过14 d的培养，成骨细胞的增殖随着表面粗糙度的增加而增加（图4）。经过14 d的培养，成骨细胞MG 3的ALP活性在D组出现峰值（图5）。

种植体表面形貌和化学组成是其生物活性和骨结合的关键[7-8]。本研究中，PEEK的表面粗糙度随着TiO2颗粒的粒度增大而增加（表1）。这个跟先前报道的钛表面喷砂研究结果吻合。改善牙科和外科种植体生物活性的一种可能方法就是增加其表面粗糙度[9-11]。本研究关注TiO2喷砂作用的效果，而纯的喷砂粗糙化的PEEK表面元素并没有改变。

PEEK被证明是一种惰性材料，而这一特性并不利于其快速的骨结合[1，12]。本研究主要致力于找出对PEEK进行TiO2喷砂的最佳粒度范围。经过在PEEK粗糙表面4 h培养，C组显示出最大的OD峰值（图2），经过7 d的培养，成骨细胞在C组显示出最大的OD值（图4）。而经过14 d的培养，成骨细胞在D组展现出最高的ALP活性（图5）。用于TiO2颗粒进行钛表面喷砂的制备微米粗糙度对种植体在骨皮质中保持稳定的最佳的颗粒粒度为180～212 μm[5]。而本研究发现，对PEEK进行喷砂的最好TiO2粒度范围存在C组180～212 μm和D组＞212～355μm。

从粗糙度的角度来看，种植体粗糙度Ra的范围应该在1～4 μm[1，8]。有报道对种植体的粗糙度进行了分级，Ra＜0.2 μm被认为是光滑的，3～4 μm被认为是粗糙的，＞6 μm被认为是很粗糙的，本研究中所有组介于中度粗糙到粗糙之间，而且全部在1～4 μm。经过3 d培养，在具有中度粗糙度的PEEK表面（图3，C组）成骨细胞细胞形貌显得更加平坦，在具有粗糙的PEEK表面（图3，E组）显得更加呈现为梭形。经过14 d的培养，细胞增殖实验检测结果OD值提示，随着TiO2颗粒粒度的增加OD值也随着增加（图4）。这可能是因为PEEK表面越粗糙，能够提供给细胞生长的空间越大。

表面化学组成和形貌对种植的骨结合来说非常重要。多种研究制备了旨在改善PEEK生物活性的PEEK复合物。经过对PEEK表面的化学组成进行了改善，但是这些研究对PEEK表面粗糙度的关注并不多。本研究用五组不同粒度的TiO2颗粒对PEEK进行喷砂处理，并且找出实验结果的多个峰值。这些结果提示，在应用于牙科和外科方面，用TiO2颗粒对PEEK进行喷砂处理存在最佳的粒度范围应该是180～355 μm。

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Studyon bioactivity of implant material polyether-ether-ketone processed by TiO2particles blasting

Wu Xiaomian1，2，Hu Xiaolei3，DengFeng1，2
（1.Chongqing Key Laboratory of Oral Diseases and Biomedical Sciences/ChongqingMunicipalKeyLaboratory of Oral Biomedical Engineering of Higher Education/College of Stomatology，Chongqing Medical University，Chongqing 400871，China；2.Department of Orthodontics，Stomatological Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400015，China；3.Key Laboratory of Clinical Laboratory Science，Ministry of Education，College of Laboratory Medicine，Chongqing Medical University，Chongqing400016，China）

ObjectiveTo find out the best granularity range of TiO2particles blasting process on polyether-ether-ketone（PEEK）.MethodsFivekindsofgranulerangeofTiO2particles（group A-E）were utilized forconducting the surface blasting process on PEEK.The surface roughness was tested，the cell attachment，cell proliferation and cell morphology were observed and alkalinephosphatase（ALP）activitywasdetected.ResultsTheroughnessofblasted PEEKsurfacewasincreased astheincreaseofTiO2particles granularity.At the same time several peak values were found.In the cell attachment test，the peak OD value appeared in the group C（blasting by 180-212 μm of TiO2particles），which was 0.566 2.After 14 d culture，the peak value of osteoblast ALP activity appeared in the group D（blasting by＞212～355 μm of TiO2particles）.ConclusionThe best granularity range of TiO2particles for PEEK surface blasting is 180-355 μm，which can provide an important reference for the future study of PEEK surface modification in thefuture.

Bone and bones； Biomechanics； Biocompatible materials； Alkaline phosphatase； TiO2；Polyetheretherketone

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.12.001

:A

:1009-5519（2015）12-1761-03

2015-03-05）

国家自然科学基金青年基金（31400808）；国家自然科学基金面上项目（81271183）。

吴晓绵（1982-），男，广东揭阳人，讲师，主治医师，主要从事口腔医学的临床、科研与教学;E-mail：wuxiaomian898@163.com。

邓锋（E-mail：deng63@263.net）。