鲁西南地区奶牛中嗜血支原体病的流行病学调查

闫振贵，李刘慧，殷韶杰，张文启，王振勇，刘翠艳，刘思当*

(1.山东农业大学 动物医学学院，山东 泰安 271018；2.安徽农业大学 动物科技学院，安徽 合肥 230036)

牛嗜血支原体病(曾称为附红细胞体病)由牛嗜血支原体(Mycoplasma wenyonii)引起，以发热、贫血、黄疸等为主要临床特征[1]，M.wenyonii 主要寄生于奶牛红细胞表面、血浆及骨髓中，为多形态、无细胞壁、无明显细胞核和细胞器的原核生物[2]。该病传播途径广泛，各季节均有发生，常常导致奶牛贫血、消瘦、生长受阻、泌乳量下降、免疫力下降，易继发其它疾病，而且还可引起怀孕奶牛流产、早产、胎衣不下，导致奶牛的繁殖力下降[3]。近年来，该病的发生不断增多，给我国奶牛业的发展造成了较大影响。山东省鲁西南地区奶牛养殖业比较集中，为了解该地区奶牛嗜血支原体病的感染情况和传播途径，本研究在2011 年1 月～2014 年1月，对该地区7 个地市的14 家规模化奶牛场的奶牛进行了M.wenyonii 感染情况的调查分析，为该病的诊断防治提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 临床样品 临床血液样品采集自鲁西南的泰安市、济南市、莱芜市、济宁市、临沂市、菏泽市、枣庄市共7 个地市的14 个规模化奶牛场，部分奶牛临床症状明显(体温高于40 ℃，贫血等)。泌乳牛及青年牛尾静脉采集枸橼酸钠抗凝血3 mL，犊牛颈静脉采集枸橼酸钠抗凝血3 mL。取4 个牛场233 份血液样品用于比较不同检测方法下奶牛感染阳性率的差异；取泰安市3 个规模化奶牛场360 头不同年龄阶段(犊牛、青年牛、泌乳牛)的奶牛血液样品，不同季节取泰安市、济南市、莱芜市的6 个奶牛场986 头奶牛及夏季7 个地市的14 个规模化奶牛场885 份泌乳牛血液样品分别用于调查不同年龄、不同季节及不同地区感染率和发病率。选取20 头阳性怀孕奶牛，产前1 周尾静脉采血，分娩时脐静脉采血，同时采集产后奶牛及新生犊牛的颈静脉血，确定M.wenyonii 的垂直传播情况。

1.2 主要试剂 Biospin 全血基因组DNA 提取试剂盒购自BioFlux 公司；r Taq DNA 聚合酶、dNTP 等PCR 相关试剂购自TaKaRa 公司；PCR 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3 常规检测方法 参考文献[4]进行直接涂片法(Blood smear)、血液悬滴压片法(Hanging drop)、瑞氏染色法(Wright's staining)及姬姆萨染色法(Giemsa's staining)检测；血液感染阳性或阴性的判定方法及标准：在400 倍光镜下观察20 个视野，红细胞中可见M.wenyonii 的判为阳性[5]，20 个视野均未见到M.wenyonii 的判为阴性。感染强度的判定标准：红细胞感染率≤25 %判为“+”；25 %～50 %判为“++”；50 %～75 %判为“+++”；75 %以上时判为“++++”。

1.4 PCR检测方法 为从4 种镜检方法中选出一种准确性较高的方法应用于基层临床检测，本实验提取血液样品DNA 进行PCR 检测[6-7]，比较镜检方法与PCR 阳性率的差异性。参考GenBank 登录的M.wenyonii 16S rRNA 序列(AY946266)，设计一对种特异性引物(5'-CGAACGAGTGGAACTTGTTCTGC-3'/5'-TAGTACCATCAAGGCGTGCTC-3')，预计扩增片段为415 bp。PCR 反应条件：94 ℃10 min；94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃90 s，32 个循环。PCR 产物经0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果

2.1 不同检测方法下奶牛感染阳性率的差异 采用4 种镜检方法对4 个牛场233 份血液样品进行检测，结果显示各阳性率存在明显的差异，其中直接血涂片法的阳性率最高，血液悬滴压片法的阳性率最低，而瑞氏染色与姬姆萨染色法结果高于悬滴压片法，但差异不显著(p>0.05)；4 种镜检方法的阳性率均高于PCR 检测阳性率，血液悬滴压片法结果与PCR 检测阳性率差异最小，因此可以联合二者作为诊断奶牛嗜血支原体病的优选方法(表1)。

表1 不同检测方法奶牛感染阳性率的比较Table 1 Comparison of the infection rates of dairy cows detected by different methods

2.2 不同年龄、不同季节、不同地区奶牛感染率和发病率

2.2.1 不同年龄奶牛感染率和发病率 对泰安市3个规模化奶牛场不同年龄的360 头奶牛血液样品采用血液悬滴压片镜检和PCR 方法进行检测，结果显示：奶牛场M.wenyonii 感染阳性率存在明显的年龄差异，泌乳牛PCR 感染阳性率高达58.0 %，与其它年龄牛差异显著(p<0.05)，犊牛阳性率达37.8 %，而青年牛的阳性率最低。3 个年龄阶段的奶牛发病率均低于10 %，泌乳牛的发病率高于犊牛和青年牛的发病率(表2)。

表2 不同年龄奶牛感染率与发病率Table 2 The infection and incidence rate of dairy cows at different ages

2.2.2 不同季节奶牛感染率和发病率 对不同季节取自泰安市、济南市、莱芜市的6 个奶牛场986 头奶牛血液样品采用悬滴压片镜检和PCR 方法进行检测，结果显示：奶牛场M.wenyonii 的感染率与季节有关，夏季感染率最高，与其它季节差异显著(p<0.05)；秋季感染率次之，冬季和春季的感染率均较低。但不同季节的发病率均不高，并且差异不显著(p>0.05)(表3)。

表3 不同季节奶牛感染率与发病率Table 3 The infection and incidence rate of dairy cows in different seasons

2.2.3 不同地区奶牛感染率和发病率 对夏季在7个地市的14 个规模化奶牛场885 份泌乳牛血液样品采用悬滴压片镜检和PCR 方法进行检测，结果显示：鲁西南7 个地区M.wenyonii 的感染率均在50%以上，最高的可达64.3 %(PCR)，但差异均不显著(p>0.05)。该结果表明各地市奶牛场普遍存在M.wenyonii 的感染情况。此外，各地区奶牛的发病率在6 %～10 %，并且差异不显著(p>0.05)(表4)。

2.3 M.wenyonii垂直传播调查结果 采用悬滴压片镜检和PCR 方法对20 对阳性母牛及其新生犊牛血液进行M.wenyonii 垂直传播调查，结果显示，分娩前无任何临床症状的母牛，其血液学检测呈阳性，其所产的犊牛大部分均感染M.wenyonii。该结果表明，母牛与犊牛间存在垂直传播(表5)。

表4 不同地区奶牛感染率与发病率Table 4 The infection and incidence rate of dairy cows in different regions

表5 M.wenyonii 垂直感染情况Table 5 The vertical transmission of M.wenyonii in dairy cows

3 讨论

关于牛嗜血支原体病的诊断方法，国内外报道的有镜检法、血清学检查、分子生物学检查等[8]。本研究联合应用镜检法和PCR 方法，对鲁西南地区规模化奶牛场中嗜血支原体病的流行病学进行了调查分析。结果显示，血液悬滴压片法检测阳性率与PCR 差异最小，而且操作简便，不需要特殊检测设备和条件，准确性高，克服了因渗透压的变化、涂片方法不当等造成的红细胞变形，又能避免染色法的弊端，因此建议基层工作者可以采用血液悬滴压片法进行M.wenyonii 的检测。

近年来，嗜血支原体病在我国广泛流行，发病范围广、感染率高、疫情复杂。聂奎等应用PCR 方法对重庆地区牛、猪和羊嗜血支原体进行分子流行病学调查，结果显示阳性率分别为11 %、76 %和16.0 %[9]。黄占欣等应用镜检法对邯郸地区奶牛附红细胞体病进行了检测，结果表明邯郸地区犊牛、泌乳牛和青年牛的感染率分别为62.3 %、52.6 %和48.2 %[10]。本研究调查结果显示，鲁西南地区奶牛普遍存在M.wenyonii 感染，并且大部分呈隐性感染状态，与李玉文等调查结果相同[11]，夏季的感染率和发病率最高，泌乳牛感染率最高，不同地区的感染率差异不显著，应引起相关部门的足够重视。

M.wenyonii 自然传播途径尚不完全清楚，该病多发生于温暖季节，尤其是吸血性昆虫大量繁殖滋生的夏、秋两季，报道较多的有吸血昆虫叮咬、血液传播、垂直传播等[12]。本次调查中阳性母牛所产的新生犊牛的感染率高达80 %，表明母牛与犊牛间存在垂直传播。同时M.wenyonii 隐性感染现象非常普遍，但临床发病率不高。一般认为该病与过度疲劳、感冒发热、贫血或感染其他寄生虫、气候突变、转群、营养不良等应激因素有关[11-12]，本研究表明奶牛分娩应激可引起嗜血支原体病发病率明显升高，这可能与奶牛产后免疫力下降、生殖道感染等因素有关。因此，要预防嗜血支原体病的发生，必须加强饲养管理，注意通风保温，消除应激诱发因素，坚持严格的卫生和消毒制度。

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[3]李桂清，彭远义.奶牛附红细胞体病研究进展[J].中国奶牛，2007，7：32-35.

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[5]秦建华，杨鹏华，刘占民，等.舍饲小尾寒羊附红细胞体病的流行病学调查[J].河北农业大学学报，2004，27(1)：86-88.

[6]谢平，刘昌林，唐成，等.奶牛附红体病的PCR 诊断[J].中国奶牛，2009，2：9-10.

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[11]李玉文，李彬，秦建华，等.奶牛附红细胞体病的流行病学调查及治疗研究[J].中国奶牛，2007，11：38-40.

[12]陈启军，尹继刚，刘明远.附红细胞体及附红细胞体病[J].中国兽医学报，2006，4：460-464.