5种喹诺酮类药物对维氏气单胞菌体外抗生素后效应的研究

张 路，徐 洋，潘晓艺，沈锦玉，夏京津，龙继兵，陈 龙，单晓枫，钱爱东

(1.吉林农业大学 动物科学技术学院，吉林 长春 130118；2.浙江省淡水水产研究所农业部淡水渔业健康养殖重点实验室，浙江湖州 313001)

抗生素后效应(Postantibiotic effect，PAE)是指抗菌药物短时间作用于细菌，在清除药物后，细菌的生长仍受到抑制的现象[1]。PAE 的单位以时间来表示，同种条件下PAE 越长药效相对越好。目前PAE已被作为设计给药方案和评价药效的重要参数之一，用于指导临床用药[2]。喹诺酮类药物是水产中允许使用并广泛使用的快速杀菌药物，自1962 年萘啶酸产生至今已有四代的发展历史，具有抗菌谱广、抗菌性强、消除半衰期长等优点[3]；但也有不利的一面，如大量使用会引起药物残留、耐药菌株出现、鱼虾大量死亡等，因此在使用前应确定合理的给药方案。

维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)又称维罗纳气单胞菌、凡隆气单胞菌，属气单胞菌科(Aermonadaceae)，气单胞菌属(Aeromonas)，是一种新型人-兽-鱼共患病原菌[4]，目前由该菌引起的水产动物疾病已有报道，并且有逐年增长的趋势，但有关其治疗却鲜有报道。因此本研究选取加替沙星、盐酸环丙沙星等5 种水产中常用的第三代喹诺酮类药物，测定其对A.veronii TH0426 株的体外PAE，为水产动物合理给药提供依据和减少抗生素滥用提供参考。

1 材料和方法

1.1 菌 株 A.veronii TH0426 株由浙江省淡水水产研究所徐洋助理研究员惠赠。

1.2 主要试剂与药品 加替沙星(纯度99 %)购自山东罗欣药业股份有限公司；盐酸环丙沙星(纯度99 %)购自上海三维制药有限公司；盐酸左氧氟沙星(纯度99 %)购自常州兰陵制药有限公司；诺氟沙星(纯度99 %)购自广州白云山制药有限公司；依诺沙星(纯度99 %)购自安徽永生堂药业有限责任公司；TSB 培养基及RS 鉴别培养基购自北京陆桥技术有限责任公司。

1.3 菌悬浊液制备 将保存的菌种划线接种于RS鉴别培养基上，30 ℃培养18 h，挑取特征性单个菌落接种于TSB 培养基中30 ℃过夜，再测定其菌液浓度。

1.4 最小抑菌浓度(MIC)的测定 采用试管二倍稀释法测定5 种喹诺酮类药物对A.veronii TH0426 株的MIC。

1.5 PAE值的测定 参照文献[5]方法有所改进，测定PAE 值。

1.5.1 PAE 的诱导 将原菌液稀释至1×106cfu/mL，分别加入5 支试管中，每管2 mL，并向其中4 支试管加入2 mL 不同浓度药液，使药液终浓度分别为8×MIC、4×MIC、2×MIC、1×MIC，第5 支试管为对照，加入2 mL 无菌生理盐水，于30 ℃中培养1 h。

1.5.2 药物去除及细菌生长动力学曲线的建立 采用400 倍稀释法去药。取上述实验组和对照组试管用TSB 培养基稀释400 倍，降低药物的有效浓度(去药)。于30 ℃培养，此时为重建后0 时，并每间隔1 h 采用平板计数法测定菌液浓度，然后以培养时间为横轴，以菌液浓度对数值为纵轴，绘制相应的细菌生长曲线。

1.5.3 PAE 计算 去药后实验组与对照组的菌落数生长10 倍所需的时间差即为PAE 值。计算公式为：PAE=T-C(T 为实验组菌落数生长10 倍所需时间，C 为对照组菌落数生长10 倍所需时间)。

1.6 数据分析 实验数据采用SPSS 软件进行统计分析。

2 结果

2.1 药物MIC检测 采用试管二倍稀释法检测5种喹诺酮类药物的MIC。结果显示，加替沙星、诺氟沙星及盐酸左氧氟沙星对A.veronii 的MIC 为0.0122 μg/mL；盐酸环丙沙星和依诺沙星为0.0488 μg/mL(表1)。

表1 5 种抗生素对A.veronii 的MICTable 1 Determination of the MIC for the 5 antibiotics against A.veronii

2.2 去除药物后细菌生长动力学曲线 将A.veronii与抗生素作用1 h 后去药，通过菌落计数法检测不同时间的细菌数A(cfu/mL)。结果显示，5 种抗生素均能够产生明显的PAE，在0～3 h 内细菌数无明显变化，3 h～8 h 内，细菌生长较快。不同药物浓度对A.veronii 的抑制程度不同，在一定范围内药物浓度越高，抑制程度越大(图1)。

图1 5 种喹诺酮类药物分别作用于A.veronii PAE 期细菌生长曲线Fig.1 The determinations of PAE to A.veronii with 5 quinolone antibiotics respectively

将实验数据通过PAE 公式计算结果显示，不同的抗生素所产生的PAE 的长短有所不同，产生PAE最长的药物为盐酸左氧氟沙星，最短的药物为诺氟沙星。对产生的PAE 时间进行两因素方差分析，在1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC 水平上分析，结果显示差异均为极显著(p<0.01)；在5 种药物水平上分析，结果显示差异显著(p<0.05)。利用LSD 法进行多重比较，在不同药物水平上分析，结果显示盐酸左氧氟沙星极显著高于其他4 种药物；依诺沙星极显著高于诺氟沙星、加替沙星，对盐酸环丙沙星差异不显著；盐酸环丙沙星极显著高于诺氟沙星，显著高于加替沙星；加替沙星极显著高于诺氟沙星(表2)。

表2 5 种抗生素对A.veronii 的PAETable 2 The PAE of 5 kinds of antibiotics against A.veronii

3 讨论

PAE 在临床用药指导方面具有不可替代的作用，涉及领域越来越广，由人体医学领域到兽医领域[6-7]，再至今天的水产养殖领域研究的内容不尽相同。对水产养殖而言，鱼类是变温动物，其生活受水环境影响很大，水温、水中溶氧、酸碱度、氨氮含量等均会使鱼类对药物的耐受力发生改变，这就会给药物投喂量的把握带来很大的难度，因此加大对鱼类的研究力度势在必行。PAE 分为体内PAE 和体外PAE[8]，由于实验条件的限制，目前研究PAE的多数为后者。影响PAE 的因素很多，包括不同菌株、不同抗生素、不同培养温度等，所以对每种菌株每种药物的研究就有一定的必要性。

本实验根据我国水产养殖中常用的抗生素，选择5 种第三代喹诺酮类药物进行A.veronii 的PAE 测定，实验结果分析表明：这5 种喹诺酮类药物产生的PAE 与药物浓度具有明显的依赖性，在1×MIC、2×MIC 药物浓度时PAE 时间相对较短，4×MIC 和8×MIC 时PAE 时间相对较长，并且随着药物浓度的增加，PAE 值趋于稳定。这个结果与苏振霞等测定的6 种抗生素对鳗弧菌的PAE 以及5 种抗生素对嗜水气单胞菌的PAE 结果大致相同[9]。而且李晖等测定的氟苯尼考对3 种海洋致病性弧菌的体外PAE，其结果也证实PAE 值与药物浓度呈现一定的依赖性，并且随着药物浓度的增加，PAE 值逐渐趋于坪值[10]。

通过分析显示，除依诺沙星与盐酸环丙沙星PAE 差异不显著之外，其余差异均为显著。由此表明不同药物的药效差异很大，对患病鱼类用药时应慎重选择药物。生产中为提高疗效应适当的延长PAE，以达到抑菌杀菌的目的。当前延长PAE 方法有：联合用药、提高单次给药剂量、采用反义制剂等[11]。在生产中应保持安全、有效、经济的原则，适当的应用这些方法，不仅可以提高疗效，还可以减少给药次数、减少应激反应、提高经济效益。虽然体外PAE 能够对药物的使用提供一定理论依据，但毕竟与体内PAE 具有一定差异，体内抗生素在作用细菌的同时能够与机体免疫系统产生协同作用，增加抑菌效果，延长PAE[12]。

总之，水产养殖生产中应慎用少用抗生素，以防止细菌产生耐药性而降低临床药品的治疗效果。因此，在用药之前，必须明确致病菌的种类、生长、繁殖、流行等特点，寻找相应的治疗方法，最终确定较优的治疗方案。

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