减肥类保健食品中非法添加的8种化学药物的筛查与测定

张斌姚家忠贾昌平陈丽波钱叶飞鲁辉

（1苏州市食品药品检验所，江苏 苏州215104；2淮南东方医院集团新庒孜医院，安徽 淮南232072）

减肥类保健食品中非法添加的8种化学药物的筛查与测定

张斌1姚家忠2贾昌平1陈丽波1钱叶飞1鲁辉1

（1苏州市食品药品检验所，江苏 苏州215104；2淮南东方医院集团新庒孜医院，安徽 淮南232072）

目的：建立高效液相色谱-二极管阵列检测器法（HPLC-DAD）结合电喷雾飞行时间质谱法（ESI-Q-TOF/MS）筛查、测定减肥类保健食品中非法添加的酚酞、芬氟拉明、麻黄碱、咖啡因、呋塞米、西布曲明及其两种衍生物。方法：采用C18色谱柱，以0.02mol/L乙酸铵溶液（0.1%乙酸）-甲醇为流动相，梯度洗脱。对HPLC-DAD检测结果呈阳性的样品进行ESI-Q-TOF一级扫描及二级碎片离子比对进行确证。结果：方法学验证结果显示HPLC-DAD法8种待测物在0.01～1.0 mg/m L范围内线性关系良好，回收率为90.41%～105.97%，RSD小于7.0%。检出限为0.10～1.68μg/m L，定量限为0.34～5.59μg/m L。结论：本实验建立的方法灵敏、可靠，可用于减肥类保健食品中这8种非法添加成分的定性、定量分析。

高效液相色谱-二极管阵列检测器法；电喷雾飞行时间质谱法；减肥类保健食品；非法添加成分

近年来，一些不法商家为谋取利益，擅自向减肥类保健食品中添加化学药品，以增加疗效，这种行为可能会对消费者的健康造成严重危害[1-2]。为此，国家制定了相关标准来检验保健食品中非法添加的酚酞、芬氟拉明、麻黄碱、咖啡因、呋塞米、西布曲明及其两种衍生物[3-5]。但是，目前国家标准对这8种成分的检测分为几种色谱方法，增加了工作量[6-7]。为此，本文尝试对上述 8种违禁添加成分进行系统合并，实现在一次分析中同时检测。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695高效液相色谱仪（配2695型分离系统、2998型二极管阵列检测器、Empower软件系统），Agilent 6538 HPLC-DAD-ESI-Q-TOF/MS液质联用仪，Thermo高速离心机，KQ-300DA数控超声波清洗器。

1.2 试药

麻黄碱（批号：171241-201007）、芬氟拉明（批号：100073-200002）、酚酞（批号：100091-199601）、咖啡因（批号：171215-201211）、呋塞米（批号：100544-201102）、西布曲明（批号：100624-200401）、N-单去甲基西布曲明（批号：520002-201301）、N，N-双去甲基西布曲明（批号：520001-201301）对照品均购自中国食品药品检定研究院。乙腈、甲醇均为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯。

2 方法

2.1 对照品溶液的配制

分别精密称取上述8种对照品适量，置25 m L量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，制得浓度分别约为 0.5，1.0 mg/m L的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的配制

分别称取1次服用剂量的片剂、胶囊，研细，置10 m L容量瓶中，加甲醇8 m L，超声处理 15 m in，放冷并定容至刻度，取适量上述溶液于13 000 r/m in离心5 m in，上清液用甲醇稀释10倍，进样分析。

2.3 色谱条件

色谱柱 Diamonsil C18柱 （4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相 0.02 mol/L乙酸铵溶液（0.1%乙酸）-甲醇；检测器 DAD；检测波长范围 210～400 nm；流速 1.0 m L/m in；柱温 30℃；进样量10μL。在上述色谱条件下，取混合对照品溶液进样测定，记录色谱图（见图 1），可见8种成分分离完全。

梯度洗脱程序见表1。

表1 对照品溶液梯度洗脱程序

2.4 质谱条件

采用 ESI源，正、负离子模式，雾化气为氮气。具体质谱参数：毛细管电压3 500 V（＋），4 000 V（－）；干燥气温度 350℃，干燥气流速10 L/m in，雾化气压力 40 psi，碎片电压135 eV；扫描范围（质荷比）：100～ 1 000。

表2 8种违禁添加成分的监测离子及相关参数

3 结果

3.1 专属性

如图1可见空白溶剂、混合对照品、阴性样品的色谱图，从图中可以看出，专属性良好。各个成分的紫外光谱、二级质谱图见图2～ 3。

图1 空白溶剂（A）、对照品（B）及阴性样品（C）的HPLC色谱图

图2 减肥类保健食品中8种非法添加化学成分的紫外吸收光谱

图2 减肥类保健食品中8种非法添加化学成分的紫外吸收光谱（续）

图3 减肥类保健食品中8种非法添加化学成分的二级质谱图

图3 减肥类保健食品中8种非法添加化学成分的二级质谱图（续）

3.2 线性、检测限、定量限

分别精密量取8种对照品储备液适量，加甲醇制成麻黄碱、芬氟拉明浓度为 0.02，0.04，0.1，0.2，0.4，1.0 mg/m L，咖啡因、呋塞米、酚酞、西布曲明、N-单去甲基西布曲明、N，N-双去甲基西布曲明浓度为 0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5 mg/m L的系列浓度混合对照品溶液。分别进样测定，记录色谱图，以峰面积 A为纵坐标，浓度C为横坐标，进行线性拟合，结果表明这8种成分在测定范围内线性关系良好（见表3）。

3.3 精密度、准确度

取某一浓度的混合对照品溶液，连续进样5次，重复3天，计算其保留时间与峰面积的日内精密度与日间精密度，结果显示精密度良好（见表4）。

表3 8种化学药物的线性范围、相关系数、检出限与定量限

准确度采用回收率试验。分别精密称取阴性样品0.15 g，共5份，各置10 m L量瓶中，加入混合对照品溶液适量，加甲醇8m L，超声处理10m in，放冷，用甲醇定容至刻度，13 000 r/m in离心5 m in，取上清液进样测定，计算得8种物质的平均回收率为 90.41%～ 105.97%，RSD均低于7.0%（见表5）。

表4 日内与日间精密度试验结果

表5 回收率试验结果（n=5）

3.4 稳定性

取某一浓度的混合对照品溶液及模拟样品，分别考察其室温放置自动进样器24 h稳定性，结果显示稳定性良好。

3.5 耐用性

取对照品溶液，分别用 Thermo BDS hypersil C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm），WondaSil C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）检测，结果显示 8种成分能有效分离，表明本法耐用性良好。

3.6 重复性试验

取检出呋塞米的阳性样品，共6份，按2.2项下供试品的制备方法平行操作，计算得呋塞米含量的RSD为1.9%。

3.7 样品测定

取20批待检样品，按2.2项下供试品溶液的制备方法处理，进样、分析。结果检测到2批阳性，见表6。

表6 阳性样品非法添加检测结果（n=3）

4 结果与讨论

4.1 萃取溶剂的选择

本实验经参考国家现有检验标准及查阅文献，发现研究的8种化学物质在甲醇中的溶解度良好，使用甲醇超声可以充分提取保健食品中非法添加的这几种成分。所以，本实验最终确定采用甲醇超声1次提取。

4.2 色谱条件的优化

本实验曾考察了甲酸、乙酸的分离效果，发现色谱峰拖尾严重，在流动相中分别加入三乙胺、乙酸铵，发现1%三乙胺抑制色谱响应，最终确定采用0.2 mol/L乙酸铵溶液（0.1%乙酸）为流动相。

本实验比较了甲醇、乙腈的分离效果，发现其分离相近，考虑到实验成本，采用甲醇作为色谱分离的有机相。

4.3 结果的确证

本实验测定8种成分的紫外吸收光谱差异，所以采用DAD记录色谱峰的光谱图，利用保留时间与光谱特征进行定性分析，选取吸收均明显的2个波长做含量测定。本实验采用HPLC对样品进行分离，DAD扫描光谱，对疑似峰进行ESI-QTOF/MS进一步确证，保证了结果的科学、可信。

5 结论

本实验首次将8种非法添加化学成分同时检测，与现有国家检测标准相比，提高了效率。方法学验证结果表明，本实验方法专属、灵敏、快速，可用于减肥类保健食品的日常检验。

[1] 张晓丹，傅小英，陈静，等.HPLC-DAD数据库快速筛查减肥类中药制剂及保健食品中的 10种非法添加化学药物[J].中国新药杂志，2012，21（2）：195-201.

[2] 张涛.LC-MS/MS法分析减肥保健食品中非法添加的酚酞[J].中国医药科学，2011，1（18）：98-100.

[3] 沈国芳，朱建，裘一婧.UPLC-MS/MS检测减肥类保健食品中的西布曲明及其去甲基衍生物[J].中国药学杂志，2011，46（20）：1609-1611.

[4] 潘正斐.UPLC/S/MS法检测保健食品中的咖啡因、酚酞和西布曲明[J].中国热带医学，2011，11（9）：1116-1117.

[5] 张小松，夏铮铮，周琳，等.检测中药保健品中非法掺入的盐酸西布曲明[J].华西药学杂志，2005，20（4）：293-295.

[6] 邱颖姮、邬晓鸥，冯丰凑，等.减肥类保健食品中违禁添加酚酞、西布曲明及其两种衍生物的检测[J].中国医药工业杂志，2012，43（10）：861-864.

[7] 黄芳，吴惠勤，黄晓兰，等.高效液相色谱-串联质谱法同时测定保健品中非法添加的六种减肥化学品 [J].分析测试学报，2013，32（6）：699-704.

Screening and Determ ination of Eight Chem icals Illegally Added in Slimm ing Health Foods

Zhang Bin1，Yao Jiazhong2，Jia Changping1，Chen Libo1，Qian Yefei1，Lu Hui1（1 Suzhou Institute for Food and Drug Control，Jiangsu Suzhou 215104，China；2 Xinzhuangzi Hospital of Huainan Dongfang Hospital Group，Anhui Huainan 232072）

Objective:A HPLC-DAD and ESI-Q-TOF/MSmethod was established for screening and determination of phenolphthalein and other chemicals illegally added in slimm ing health foods including fenfluram ine，ephedrine，caffeine，furosemide，sibutramine and its two derivatives.Methods:C18column was used w ith themobile phase of 0.02 mol/L ammonium acetate solution （0.1%acetic acid）-methanol and gradient elution was conducted.The positive samples from HPLC-DAD test resultswere scanned by ESI-Q-TOF and confirmed by two grade of fragmention comparison.Results:Themethod validation showed that there was a good linear relationship of eight determ inands w ithin the range of 0.01～1.0 mg/m L by HPLC-DAD，the recovery rate was 90.41%～105.97%，and RSD was less than 7.0%.The detection limit was 0.10～ 1.68μg/m L and the lim it of quantification was 0.34～ 5.59μg/m L.Conclusion:This method is sensitive and reliable，it can be used for the qualitative and quantitative analysis of the eight components illegally added in slimming health foods.

HPLC-DAD；ESI-Q-TOF/MS；Slimming Health Food；Illegally Added Compound

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.03.006

2014-12-15）

张斌，男，硕士，药师。研究方向：药物质量控制与评价。通讯作者E-mail：kimmynepia@vip.qq.com