对碳青霉烯类抗菌药不敏感肠杆菌科细菌耐药性分析

李春娟董爱英韩晓燕

（1河北联合大学，河北 唐山 063000；2河北联合大学附属医院检验科）

对碳青霉烯类抗菌药不敏感肠杆菌科细菌耐药性分析

李春娟1董爱英2韩晓燕2

（1河北联合大学，河北 唐山 063000；2河北联合大学附属医院检验科）

目的：了解我院临床分离的对碳青霉烯类抗菌药不敏感的肠杆菌科细菌对常用抗菌药物的耐药性。方法：收集2013年4月-2014年3月我院临床分离的30株对碳青霉烯类抗菌药不敏感的肠杆菌科细菌，使用由美国BD公司生产的Phoenix-100全自动细菌鉴定/药敏系统进行菌株鉴定和药敏试验，产碳青霉烯酶的表型确证采用改良Hodge试验。结果：30株对碳青霉烯类抗菌药不敏感的肠杆菌科细菌对多黏菌素、阿米卡星和复方新诺明的敏感率较高，依次为100.0%，73.3%和66.7%；对碳青霉烯类抗菌药亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为100.0%和86.7%；对氨苄西林、头孢菌素类、含β-内酰胺酶抑制剂的复合制剂和单环β-内酰胺类抗菌药的耐药率均为100.0%；对其余抗菌药的耐药率均在60.0%以上。30株菌的改良Hodge试验阳性率为86.7%（26/30）。结论：对碳青霉烯类抗菌药不敏感的肠杆菌科细菌对常用抗菌药物表现为高度多重耐药，为高产碳青霉烯酶菌株。为防止产碳青霉烯酶基因的流行，临床应合理使用抗菌药物并加强对肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶的监测。

肠杆菌科细菌；碳青霉烯酶；耐药性分析

碳青霉烯类抗菌药是抗菌谱广，抗菌活性强的β-内酰胺类抗菌药，因其对绝大多数由质粒或染色体介导的β-内酰胺酶都有较高的稳定性[1]以及毒性低等特点，已经成为治疗严重细菌感染最主要的抗菌药物之一，被称为治疗革兰阴性菌感染的最后一道防线[2]，是目前治疗产超广谱 β-内酰胺酶（ESBLs）和头孢菌素酶（AmpC）的多重耐药肠杆菌科细菌引起感染最有效的抗菌药物[3]。近年来，碳青酶烯类抗菌药耐药肠杆菌科细菌所致感染爆发的报道呈现上升趋势，其耐药机制主要是产生碳青霉烯酶，给临床抗感染治疗带来了严峻挑战。为了解对碳青霉烯类抗菌药不敏感的肠杆菌科细菌的临床分布及耐药情况，现将30株对碳青霉烯类抗菌药不敏感的肠杆菌科细菌对常用抗菌药物的耐药性报道如下。

1 资料与方法

1.1 菌株来源

收集我院2013年4月 -2014年3月临床标本中分离的肠杆菌科细菌，筛选出对碳青霉烯类抗菌药不敏感的肠杆菌科细菌30株。

1.2 仪器与试剂

美国BD公司生产的Phoenix-100全自动细菌鉴定仪及BD公司的配套试剂，温州市康泰生物科技有限公司生产的培养基，英国Oxoid公司的药敏纸片。

1.3 质控菌株

铜绿假单胞菌ATCC27853，大肠埃希菌ATCC 25922，金黄色葡萄球菌ATCC25923，肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705，肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706。

1.4 试验方法

1.4.1 药敏试验使用由美国BD公司生产的Phoenix-100全自动细菌鉴定/药敏系统，按仪器操作说明进行菌株鉴定和药敏试验，结果判读依照美国临床实验室标准化研究所（CLSI）2012年标准[4]进行。

1.4.2 改良Hodge试验①使用无菌生理盐水将大肠埃希菌ATCC25922菌悬液调至0.5麦氏浊度，并用生理盐水进行1∶10稀释。②用棉签将稀释后菌液均匀涂布于MH琼脂平板上，干燥3～10 m in，中间贴美罗培南纸片。③使用10μL接种环挑取3～ 5个过夜生长待测菌落或质控菌株，垂直于美罗培南纸片从纸片边缘开始划线，长度为20～25 mm，（35±2）℃孵育16～20 h。④结果判读：如果在被测菌株与大肠埃希菌ATCC25922抑菌圈交汇处大肠埃希菌生长增强，即为改良Hodge试验阳性，产碳青霉烯酶。肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705为阳性质控菌、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706为阴性质控菌。

1.4.3 数据分析采用世界卫生组织细菌耐药性监测网Whonet 5.5软件进行数据分析。

2 结果

2.1 菌株分布及标本资料

我院2013年4月 -2014年3月临床标本中分离出对碳青霉烯类抗菌药不敏感的肠杆菌科细菌共30株，其中肺炎克雷伯菌16株，占53.3%，阴沟肠杆菌12株，占40.0%。这些细菌来自不同的科室，主要分布在重症医学科 15株（50.0%），神经内科重症病房8株（26.7%）。患者平均年龄约为74岁，多有较严重的呼吸道疾病，心脑血管疾病，严重外伤，重症感染等基础疾病，平均住院时间7.7个月，见表1。

2.2 药敏试验

30株对碳青霉烯类抗菌药不敏感的肠杆菌科细菌对多黏菌素、阿米卡星和复方新诺明的敏感率较高，依次为100.0%，73.3%和66.7%；对碳青霉烯类抗菌药亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为100.0%和86.7%；对氨苄西林、头孢菌素类、含β-内酰胺酶抑制剂的复合制剂和单环β-内酰胺类抗菌药的耐药率均为100.0%；对其余抗菌药的耐药率均在60.0%以上，见表2。

表1 30株细菌标本资料

2.3 碳青霉烯酶表型确证试验

30株肠杆菌科细菌，26株改良Hodge试验阳性 ，阳性率为86.7%。

3 讨论

碳青霉烯类抗菌药抗菌谱广，抗菌活性强，杀菌作用快，因此是目前治疗ESBLs或AmpC的多重耐药肠杆菌科细菌引起感染最有效的抗菌药物。1998-2004年美国的SENTRY监测中，没有发现对碳青霉烯类抗菌药耐药的肠杆菌科细菌。然而近几年，随着碳青霉烯类抗菌药在临床上的大量应用，对碳青霉烯类抗菌药不敏感的肠杆菌科细菌在不断出现。中国CHINET细菌耐药监测网报道，2005-2010年临床分离对碳青霉烯类抗菌药耐药肠杆菌科细菌从0.4%上升到8.5%[5]。

表2 30株细菌对抗菌药物的耐药率及敏感率

肠杆菌科细菌包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌等常见的重要条件致病菌，可引起腹腔、泌尿道、血液、呼吸道等多个部位的感染。本研究中我院2013年4月 -2014年3月临床标本中分离出对碳青霉烯类抗菌药不敏感的肠杆菌科细菌共30株，其中以肺炎克雷伯菌最多（16株，53.3%），其次为阴沟肠杆菌（12株，40.0%）。这些细菌来自不同的科室，主要分布在重症医学科（15株，50.0%）、神经内科重症病房（8株，26.7%）。这两个科室多为老年及危重症患者，基础疾病严重，长期使用大剂量广谱抗菌药，机体免疫力低下，有些患者须进行气管切开及机械通气、留置导尿管、胃管、静脉留置导管等侵入性治疗，这些都易导致耐碳青霉烯类抗菌药菌株的产生。由表1还可以看出，30株细菌所分离自的患者平均年龄约为74岁，多有较严重的呼吸道疾病如重症肺炎、慢性阻塞性肺疾病，心脑血管疾病如脑梗死、脑出血，严重外伤，重症感染等基础疾病，平均住院时间7.7个月。这是因为老年人身体虚弱，抵抗力低下，加之患有较严重的基础疾病，病程普遍较长需要长期住院治疗，这些都是耐药菌产生的诱发因素。

碳青霉烯酶能水解青霉素类、头孢菌素类、单环β-内酰胺类和碳青酶烯类等抗菌药[6]，故可表现为对抗菌药物的高度耐药，给临床治疗带来很大困难，应引起临床高度重视[7]。本研究中对碳青霉烯类抗菌药不敏感的肠杆菌科细菌对常见抗菌药物也表现为高度多重耐药，对氨苄西林、头孢菌素类、含β-内酰胺酶抑制剂的复合制剂和单环β-内酰胺类抗菌药的耐药率均为 100%；对碳青霉烯类抗菌药亚胺培南和美罗培南的耐药率也分别达到了100%和86.7%；对其余抗菌药的耐药率均在60%以上，而对多黏菌素的敏感率最高（100%）、其次为阿米卡星（73.3%）和复方新诺明（66.7%）。多黏菌素属多肽类抗菌药，系窄谱慢效杀菌药，对繁殖期和静止期细菌均有杀菌作用，主要作用于细菌胞浆膜，同时也可进入细菌体内影响核质和核糖体的功能，对革兰阴性杆菌具有强大抗菌活性，不易耐药。但由于对其药物代谢、药物效应动力学和不良反应缺少了解，多黏菌素的临床应用较少，因此敏感率最高。阿米卡星和庆大霉素同为氨基苷类抗菌药，但本研究中对碳青霉烯类抗菌药不敏感的肠杆菌科细菌对二者的敏感率却相差很大，前者为73.3%，后者为20.0%，主要原因是细菌所产生的氨基苷类钝化酶以AAC（3）-Ⅱ为主，对前者的水解能力较弱。该类药物对轻度感染者可单用，但中、重度感染者则需与其他药物联合应用，且用药期间应注意耳毒性和肾毒性。

改良Hodge试验是CLSI推荐用于检测碳青霉烯酶表型的有效方法，此方法的敏感性和特异性均＞ 90%[8]。30株肠杆菌科细菌，26株改良Hodge试验阳性，阳性率为86.7%。说明对碳青霉烯类抗菌药不敏感的肠杆菌科细菌为高产碳青霉烯酶菌株。聚合酶链式反应（PCR）常作为检测碳青霉烯酶基因的金标准[9]，因此对耐药菌株产碳青霉烯酶的基因确证与基因分型有待进一步研究。

肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶情况日益增多，这些菌株又常常合并 ESBLs和AmpC，菌株表现为高度多重耐药，可供选择的抗菌药物非常有限，临床对于产酶菌株引起感染的治疗数据非常少。因此临床应加强细菌对抗菌药物耐药性的监测，并根据病原菌的种类以及药敏试验结果制定有效且合理的治疗方案，以减少产碳青霉烯酶菌株的产生和流行[10]。

[1] 魏丽华，余兰.肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶研究进展[J].医学信息，2011，24（3）：1464-1466.

[2] 梁慧，彭国均，张薇，等.产KPC型碳青霉烯酶肠杆菌科细菌感染的临床和微生物学特点[J].中国感染与化疗杂志，2013，13（2）：143-146.

[3] 董方，宋文琪，徐樨巍，等.对碳青霉烯类抗菌药不敏感肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶基因型研究[J].中国感染与化疗杂志，2013，13（4）：270-274.

[4] CLSI.Performance standards for antim icrobial susceptibility testing；Twenty second Informational supplement[S].CLSI document M 100-S22，2012.

[5] 汪复，朱德妹，胡付品，等.2010年中国CHINET细菌耐药性监测[J].中国感染与化疗杂志，2011，11（5）：321-329.

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[8] Pasteran F，Mendez T，Rapoport M，et al.Controlling false-positive results obtained with the Hodge and Masuda assays for detection of class a carba-penemase in species of enterobacteriaceae by incorporating boronic acid[J].JClin M icmbiol，2010，48（4）：1323-1332.

[9] 张成宪，金凤玲.改良Hodge试验检测产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的诊断价值的系统评价[J].国际检验医学杂志，2012，33（22）：2710-2711.

[10] 吕金娥，许云敏，杜艳.新生儿重症监护室肠杆菌科产碳青霉烯酶株的耐药性分析[J].检验医学与临床，2013，10（6）：732-733.

Drug Resistance Analysis of Carbapenem-nonsusceptible Enterobacteriaceae

Li Chunjuan1，Dong Aiying2，Han Xiaoyan2（1 Hebei United University，Hebei Tangshan 063000，China；2 Clinical Laboratory Department of the A ffiliated Hospital of Hebei United University）

Objective:To understand the drug resistance of carbapenem-nonsusceptible Enterobacteriaceae to commonly used antim icrobial drugs.Methods:About 30 strains of carbapenem-nonsusceptible Enterobacteriaceae were isolated from the patients in our hospital from April 2013 to March 2014.The strain identification and drug susceptibility tests were performed by the use of Phoenix-100 automatic bacterial identification/drug susceptibility system produced by America BD company.The phenotyes of carbapenemase producing strains were identified by modified Hodge test.Results:The higher sensitive rates (100.0%，73.3%and 66.7%)of 30 strains of carbapenem-nonsusceptible Enterobacteriacea to polymyxin，am ikacin and cotrimoxazole were showed.The resistance rates of carbapenem antibiotics to im ipenem and meropenem were 100.0%and 86.7%.A ll the isolates were resistant to the commonly used ampicillin， cephalosporins， the compound preparation containing β-lactamase inhibitor and monobactams antibiotics，and the resistance rates to other antibiotics weremore than 60.0%.About 26 strains(86.7%)showed positive in the modified Hodge test.Conclusion:Carbapenem-nonsusceptible Enterobacteriaceae are high-yielding strains of carbapenemase w ith a high degree of multidrug resistance.To prevent such strains producing popular carbapenemase gene，antibiotics should be used reasonably in clinical practice and the monitoring the production of carbapenemases should be strengthened.

Enterobacteriaceae；Carbapenemase；Drug Resistance Analysis

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.03.005

2014-12-19）

唐山市科技计划项目（14130212a）

李春娟，女，在读硕士。研究方向：病原微生物感染诊断。E-mail：lichunjuan1988@126.com

董爱英，女，教授。研究方向：临床微生物检验。通讯作者E-mail：heweijun@126.com