ASPP1在妊娠滋养细胞疾病的表达下调与超甲基化、凋亡活动及葡萄胎预后相关性的研究

郝志敏，朱虹

(宁波大学医学院附属医院，浙江 宁波315000）

·临床研究·

ASPP1在妊娠滋养细胞疾病的表达下调与超甲基化、凋亡活动及葡萄胎预后相关性的研究

郝志敏，朱虹

(宁波大学医学院附属医院，浙江 宁波315000）

目的探讨ASPP1在不同滋养细胞组织中促甲基化作用和表达水平，以及在体外绒毛膜癌JEG-3和JAR细胞株的效应，判定其与葡萄胎恶变的相关性。方法 通过定量PCR和免疫组化技术，检测滋养细胞中ASPP1 mRNA表达水平。用MS-PCR技术评估ASPP1 mRNA表达与甲基化状态相关性，及ASPP1在正常胎盘和妊娠滋养细胞疾病中表达差异。用TUNEL法检测ASPP1表达与增殖指数（Ki67，MCM7）、凋亡指数（M30细胞凋亡抗体）、P53、caspase-8相关性。结果免疫组化结果显示ASPP1在绒毛膜癌和葡萄胎中表达低于正常胎盘组织中的表达(P＜0.01），进展为持续性葡萄胎组低于自然消退组，差异有统计学意义 （P＜0.05）。ASPP1表达与增殖指数（Ki67，MCM7）、凋亡指数(M30）、P53、caspase-8高度相关。ASPP1通过内源性与外源性路径诱导凋亡，上调活化的caspase-9及配体蛋白的表达。结论ASPP1通过超甲基化的表达下调进而诱导凋亡可能在葡萄胎的发病机制及葡萄胎恶变中发挥作用。

凋亡；ASPP1；绒毛膜癌；妊娠滋养细胞疾病；超甲基化；甲基化

葡萄胎是一种良性疾病，多数葡萄胎在吸宫后病灶自然消退，然而仍有10%～20%葡萄胎会进展成持续性滋养细胞肿瘤而需要化疗[1]。对于滋养细胞疾病的发病机制已进行过大量的遗传学和生物学研究，但其发病机制尚不明确，既往研究表明滋养细胞的凋亡下降可能导致滋养细胞的侵袭与转移。P53凋亡刺激蛋白1（ASPP1）能够与P53蛋白结合增强该蛋白的促进细胞凋亡的功能，发挥抑制肿瘤的作用[2]；近来研究表明ASPP1在野生型P53阳性的人类癌细胞株中表达下调，如乳腺癌[3]，小细胞肺癌[4]及急性粒细胞白血病[5]，但关于ASPP1在滋养细胞中的作用机制研究甚少。本研究中，为了揭示ASPP1在妊娠滋养细胞疾病发病机制及临床预后中的作用，本文检测ASPP1在正常胎盘组织及滋养细胞疾病中的表达及甲基化状态以及其与临床参数的相关性，同时进行了体外细胞功能分析。

1 材料与方法

1.1材料 检测87例滋养细胞标本，包括19例早期正常绒毛组织，13例足月胎盘，50例完全性葡萄胎（妊娠5～28周，平均14周），5例绒毛膜癌，在完全性葡萄胎组中42例良性转归，8例发生恶变。葡萄胎及绒毛膜癌标本来自于宁波大学医学院附属医院妇产科2009～2012年病理存档的石蜡切块。采用定时PCR和MS-PCR技术，提取50例葡萄胎，5例绒毛膜癌，13例足月胎盘和19例早期正常绒毛组织的cDNA及DNA。早期绒毛组织为人工流产的新鲜组织，足月胎盘为正常分娩后的胎盘组织，葡萄胎或绒毛膜癌组织为吸宫术或子宫切除术的标本。所有组织均获得伦理委员会的批准，并符合组织学诊断标准。葡萄胎后发展为持续性滋养细胞肿瘤的诊断凡符合下列标准中的任何一项且排除妊娠可能即可诊断为妊娠滋养细胞肿瘤（GTN）：（1）葡萄胎排空后HCG测定连续4次呈平台状态

（±10%），并持续3周或更长时间 ，即1、7、14、21日； （2）葡萄胎排空后HCG测定连续3次 升高（＞10%），并至少持续2周或更长时间，即1、7、14日；（3）葡萄胎排空后HCG水平持续异常达6个月或更长时间；（4）组织学诊断。

1.2方法 葡萄胎组织经过显微镜切割及染色体原位杂交后进行荧光微卫星基因定位。从数据库中检索增殖与凋亡指数与ASPP1免疫反应的相关性。

1.2.1免疫组化试验4μm石蜡切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化；置入柠檬酸缓冲液 （pH= 7.6），在高压锅中进行抗原修复，加热至沸腾l分钟，室温下冷却15分钟；每张切片滴加30μL内源性过氧化物酶阻断剂（试剂A），以阻断内源性过氧化物酶的活性，ASPP1（LXO54.2）（Sigma、St Louis、MO、USA）鼠抗人单克隆抗体1：200稀释、孵化，新鲜配制的DAB显色液，镜下控制显色，苏木素复染细胞核，常规脱水、透明、封片，显微镜观察、摄片。免疫组化用PBS代替一抗作为阴性对照，已知的正常早期绒毛组织作为阳性对照。判定标准：阳性染色为细胞浆着色，细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性，根据阳性细胞百分率来判定结果:无细胞显色为（-）；0%～25%细胞显色为（+）；25%～50%细胞显色为 （++）；50.1%～75.0%细胞显色为（+++）；75.1%～100%细胞显色为 （++++）。ASPP1蛋白阳性定位以细胞浆和/或细胞核出现棕黄色显色为ASPP1蛋白表达阳性细胞，每个视野计数200个细胞，共计5个高倍视野的阳性细胞数。免疫组化结果采用半定量计分法判定，根据Remmele和stegner提出的免疫反应积分（IRS）打分，它采用染色强度（SI）和阳性细胞百分比（PP）的乘积，即IRS=SI×PP，分级如下，IRS：0～3分为阴性（－），4～6分为弱阳性 （+），8～9分为中度阳性（++），12分为强阳性（+++）。

1.2.2定时定量PCR根据已知的研究程序实施定量PCR。Trizol试剂 （Invitrogen，Life Technologies Inc.，Rockville，MD，USA）提取2.5μgRNA，用寡核苷酸作为引物通过逆转录聚合酶连反应合成DNA，在ABI PRISM 7900序列检测体系（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）实施定量PCR。使用的引物详见表1，磷酸甘油醛脱氢酶DNA扩增作为对照组。以磷酸甘油醛脱氢酶表达为标准，用2DDCT方法确定ASPP1表达。

1.2.35-脱氧胞苷和曲古柳菌素处理绒毛膜癌细胞 人绒毛膜癌JEG-3及JAR细胞系引自北京中国科学院动物研究所计划生育及生殖生物学国家重点实验室。绒毛膜癌细胞株在10%胎牛血清及100U/mL青霉素及链霉素组成的培养基中培养。处理JEG-3和JAR细胞，5 mM 5’-aza-2’脱氧胞苷

（5-aza-dc，Sigma）培养3天，0.3 mM曲古柳菌素（TSA，Sigma）培养1天，然后两者结合（5 mM 5-aza-dc两天，然后5 mM 5-aza-dc和0.3 mM TSA 1天）。以中介物二甲基亚砜作为对照组，在预定的时间内收集细胞。

1.2.4DNA配置、亚硫酸钠修复和MS-PCR在未甲基化的胞核嘧啶经过蛋白激酶K的消化并利于硫酸氢钠处理时转化成尿嘧啶，然后用苯酚氯仿提取5μgDNA，用QIAEX II kit（Qiagen，Hiden，Germany）提纯DNA，根据已知的MS-PCR分析的研究，甲基化和未甲基化敏感的引物，如表1所示，被设计用来扩增ASPP1启动基因 （-681 to-476）（GeneBank NM 015316）。甲基化DNA（Chemicon，Atlanta，GA，USA）作为PCR阳性对照，没有模板的空白链作为阴性对照。在95℃烤箱中放置10分钟使蛋白变性，然后95℃、59℃、72℃各30秒。PCR完成了35个周期，30秒在95℃，30秒在55℃。在2%的琼脂凝胶电泳中分离MS-PCR产物，溴化乙锭染色，紫外线照射成像。

1.2.5ASPP1转染、蛋白印记分析，亚细胞定位用脂质体法2000将ASPP1合成物转染到JEG-3和JAR培养基。反向转录脱氧核糖核酸（PCDNA）定量3.1作为对照组，用含有蛋白抑制剂的SDS缓冲液提取总蛋白溶解液。用亲和性洗涤剂 （Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA）蛋白实验确定蛋白含量。通过SDS-PAGE溶解20μg蛋白转染到氯乙烯细胞膜，再针刺到相对应的抗体中。蛋白印记使用的抗体详见表2。用ProteoExtract Native细胞膜蛋白提取基 （Calbiochem，San Diego，CA，USA）分离JEG-3细胞核和细胞质。

1.2.6转移酶介导的三磷酸脱氧鸟苷-生物素刻痕末端标记 用原位细胞死亡检测基（Roche Biochemical，Indianapolis，IN，USA）实施转移酶介导的三磷酸脱氧鸟苷-生物素刻痕末端标记（TUNEL）。TUNEL阳性细胞数作为对照组，用ASPP1转染后的JEG-3和JAR阳性细胞数在光学显微镜下呈40倍放大，观察3个视野。

1.3统计学处理 应用SPSS16.0统计软件包进行处理。χ2检验检测各组的甲基化计数资料；两样本间的计量资料比较采用t检验；采用Spearman等级相关分析ASPP1和增殖指数及凋亡指数的相关性。

2 结果

2.1ASPP1在绒毛膜癌和葡萄胎中表达下调，而且与葡萄胎的进展有关 研究结果显示，ASPP1免疫组化染色主要定位于绒毛细胞滋养细胞及绒毛外中间型滋养细胞的细胞质，在合体滋养细胞、绒毛间质、蜕膜染色较浅且局限（第76页图1A-1E），和早孕绒毛组织相比，绒毛膜癌和葡萄胎的ASPP1免疫表达下调（图1）。在绒毛膜癌的合体滋养细胞

ASPP1免疫表达范围局限，强度弱 （第76页图1E），更重要的是，在细胞滋养细胞的ASPP1表达在葡萄胎恶变组显著低于良性转归组（P＜0.05），详见表3。ASPP1抗体在JEG-3的亚细胞片段的蛋白印记分析显示在细胞质强表达175 kDa，而在细胞核无表达（图2）。研究结果与ASPP1在免疫组化中细胞质表达一致。

2.2ASPP1启动区甲基化状态与mRNA表达相关性 在cDNA样本检测的定量PCR结果表明：mRNA在正常早期绒毛组织的表达高于葡萄胎（P=0.003）及绒毛膜癌（P=0.001）（图3）。ASPP1 mRNA在绒毛膜癌中的表达低于葡萄胎。ASPP1在足月胎盘中的表达水平高于其在早期绒毛组织中的表达（P=0.004）。体外研究表明，JEG-3经过5-氮-2’-脱氧胞苷（5-aza-2’-deoxycytidine）处理后ASPP1表达上升2倍，经过曲古柳霉素A（TSA）处理后ASPP1表达上升5倍，而在JAR中分别上升2倍和7倍。两种药物双重处理JEG-3及JAR后ASPP1 mRNA表达分别上升10倍和5倍 （图4）。结果表明，DNA甲基化可能与ASPP1失活在妊娠滋养细胞疾病中发挥重要作用有关。甲基化PCR研究表明，葡萄胎中DNA甲基化等位基因频率高于正常胎盘组织 （图5）。甲基化ASPP1等位基因表达在葡萄胎中为34.8%（16/ 46）在正常早期绒毛中为11.8%（2/17），足月胎盘中为22.2%（2/9）。此外，ASPP1 mRNA表达与甲基化状态高度相关（r=0.702，P=0.029）。绒毛膜癌同时含有甲基化及未甲基化状态的ASPP1的等位基因（图5）。

2.3ASPP1在JEG-3和JAR中过度表达诱导凋亡和上调配体表达 为了探索ASPP1在凋亡中的作用，在JEG-3和JAR细胞中实施了ASPP1瞬时转染。蛋白印迹转染48小时后评估转染效应。如TUNEL实验所述，JEG-3和JAR空白载体凋亡细胞数百分比分别为2.4%和3.5%，然而ASPP1过度表达可以使凋亡细胞数分别升高到9.4%和13.3%，详见第76页图2A-2B和第77页图1。

数据库中检索葡萄胎中增殖指数 （Ki67和MCM7）、M30凋亡指数、P53的表达与ASPP1表达相关性。结果表明ASPP1与P53呈负相关 （r=-0.482；P＜0.001）Ki67（r=-0.304；P=0.020）MCM7增殖指数 （r=-0.409；P=0.016），M30表达的凋亡指数（r=-0.397；P=0.004）。此外，ASPP1表达与caspase-8的免疫表达呈正相关（r=0.458；P=0.024），而ASPP1转染的绒毛膜癌细胞caspase-9表达升高，说明ASPP1可以通过内源性凋亡路径刺激凋亡。同时还发现ASPP1免疫计数与caspase-8呈正相关，故caspase-8在妊娠滋养细胞疾病凋亡外源性路径中表达下调。ASPP1异位表达定量PCR研究发现配体mRNA表达增加，但是受体和TRAF2表达不变,还发现配体受体mRNA表达中等强度增加。后来的蛋白印迹分析结果表明在ASPP1过度表达后出现配体蛋白表达上调（图6-7），其中FasL和Fas表达明显上调。在妊娠滋养细胞疾病中ASPP1及caspase-8表达均下调，说明ASPP1可能通过Fas/FasL体系控制凋亡的外源性路径。

3 讨论

滋养细胞对于受精卵的着床、胎盘形成及胎儿的生长发育发挥至关重要的作用，在滋养细胞发生侵袭、转移时的分子机制或信号传导路径发生改变可能导致葡萄胎的发生及恶变[6]。既往研究表明凋亡在滋养细胞疾病的发病机理中尤为重要[7-9],而对P53相关基因及调控基因的研究有助于了解滋养细胞疾病的发病机制，ASPP1能够与P53蛋白结合继而促进细胞凋亡。

对滋养细胞及绒毛膜癌细胞进行免疫组化和微量蛋白印记分析，结果表明ASPP1免疫反应主要定位于细胞滋养细胞和中间型滋养细胞的细胞质，和ASPP1首次报道结果相一致[10-11]。本研究中，用ASPP1抗体LOX54.2判定ASPP1N端（1-308），具有完整N端调控区的长链ASPP1将其免疫反应最大化，对P53的转活刺激强度强于缺少N端调控区的ASPP1转染。因此，抗ASPP1抗体LOX54.2可以辨认内在的完整的ASPP1，其可以显示P53完整的调控功能。虽然ASPP1表达定位于细胞质，P53表达定位于细胞核，但是既往研究表明，ASPP1含有靶序列将其导向细胞质，ASPP核心转染区（872-1090）和绿色荧光蛋白溶合蛋白导致合成物定位于细胞核[12]，然而全长的ASPP1（1-1090）-GFP融合蛋白表达主要定位于细胞质，后者符合本文的免疫组化结果，可能是因为转录后的基因修复和结合蛋白有助于ASPP1在不同亚细胞分割间的

交换，然后充分发挥其生物作用。ASPP1在滋养细胞肿瘤中表达定位于细胞滋养细胞及中间型滋养细胞，有学者认为正是这两种细胞的干细胞的特性决定了滋养细胞肿瘤的发生[13]。

本次免疫组化研究还发现，ASPP1表达在足月胎盘及正常早孕绒毛组织中最高，在葡萄胎良性转归组及恶变为滋养细胞肿瘤组的表达依次降低，在绒毛膜癌细胞株中表达最低，说明ASPP1低表达预测葡萄胎有一定的恶变潜能，与Mak等[14]的研究结果相一致，认为ASPP1通过内源性与外源性路径诱导凋亡，上调活化的半胱天冬酶9及配体蛋白的表达，故推测ASPP1的凋亡表达逐渐丢失可能阻碍了细胞滋养细胞和绒毛中间型滋养细胞的日益凋亡，导致滋养细胞肿瘤的发生。

定量PCR结果表明ASPP1 mRNA在正常早期绒毛组织的表达高于其在葡萄胎及绒毛膜癌组织中的表达，在绒毛膜癌中的表达低于葡萄胎，在足月胎盘中的表达水平高于其在早期绒毛组织中的表达，再次证明了滋养细胞的凋亡下降导致滋养细胞肿瘤的发生。用5-aza-dc处理mRNA后的表达，结果表明，在妊娠滋养细胞疾病的进展中，反向DNA甲基化有助于ASPP1表达下调。肿瘤抑制基因的DNA超甲基化和干细胞转录因子在妊娠滋养细胞疾病中的表达已有报道[15]。此外，用组蛋白去

乙酰化酶抑制剂TSA和去甲基化5-氮脱氧胞苷处理细胞，可以协同激活ASPP1 mRNA的表达，在SOX2的研究中已报道过[16]。基因去甲基化和组蛋白去乙酰化酶是必不可少的，但是还包括外源性调节机制。甲基胞嘧啶结合蛋白能够启动HDAC和组蛋白甲基转移酶，然而DNA甲基转移酶能够直接结合HDAC，表明了DNA甲基化和组蛋白去乙酰化相互作用。有趣的是，TSA诱导ASPP1 mRNA表达活力高于5-氮脱氧胞。近来研究发现TSA通过组蛋白去乙酰化作用在甲基化肿瘤抑制基因中能够诱导DNA去甲基化，TSA对组蛋白去乙酰化和DNA去甲基化的选择性交叉反应能够影响ASPP1表达[17]。

通过检索数据库分析ASPP1和P53、增殖指数（Ki67 and MCM7）、凋亡指数（M30）的相关性分析时呈负相关，表明ASPP1可能在妊娠滋养细胞疾病中平衡增殖与凋亡，具有重要意义。

ASPP1与P53结合，通过内源性路径激活凋亡基因的转录，如BAX、PUMA。研究结果表明，表达野生型P53的绒毛膜癌细胞中ASPP1的表达可以诱导凋亡，同时活化的caspase-9表达增加，证明ASPP1激活凋亡的内源性路径，作者还发现ASPP1和caspase-8的全部形式具有相关性。在以前的凋亡实验中已报道，caspase-8是凋亡外源性路径的一个成员，其表达在绒毛膜癌组与正常胎盘组织相比显著下调[18]。作者研究证明了在绒毛膜癌细胞中配体和受体共同表达以及在ASPP1转染后配体表达上调，是ASPP1诱导凋亡的外源性路径。组织的生理性细胞转化中，配体和受体的共同表达与凋亡细胞死亡有关[19]，滋养细胞中配体和受体通过自分泌和旁分泌机制相互作用[20]。总之，研究结果揭示了ASPP1和Fas/FasL体系可能相互作用，特别是在有活力的滋养细胞的凋亡的外源性路径。

综上所述，本文探索了滋养细胞疾病中ASPP1通过超甲基化诱导凋亡的表达下调与葡萄胎的进展及恶变相关，还揭示了滋养细胞中凋亡的外源性路径中ASPP1和Fas/FasL相互作用，提示ASPP1可能通过凋亡效应在妊娠滋养细胞疾病发病机制及预后中发挥重要作用。

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