高效毛细管电泳法测定食品中5种甜味剂含量

薛洪宝， 张 晖*， 梁丽丽， 杨俊松， 申 林， 陶兆林

（1.蚌埠医学院 化学教研室，安徽 蚌埠 233030；2.蚌埠医学院 科研中心，安徽 蚌埠233030）

随着全球食品工业的日益发展，消费者对食品安全提出的要求越来越高，但近些年国内外食品安全恶性事件屡有发生，对人类健康威胁严重，食品安全问题已经成为当今世界关注的热点之一[1]。高效毛细管电泳（HPCE）拥有色谱和电泳技术的共同优点，具有诸多高效分离模式，可以在很大程度上满足基体复杂的食品分析要求[2]。因此，HPCE在食品分析方面的应用日趋广泛。

纽甜、阿斯巴甜、甜蜜素、糖精钠、安赛蜜等人工合成甜味剂由于甜度高、用量少，具有高效、经济等优点，常用以代替蔗糖添加到食品中[3]；此类食品添加剂具有热值小，多不参与代谢，口味好，尤其博得肥胖、糖尿病、高血压、龋齿等患者的青睐[4]。为了改善食品口味、风味等，生产商往往在一种食品中同时添加多种甜味剂。但每种甜味剂都有一定的使用范围和添加限量，如果过量使用会影响身体健康[5-6]，长期摄入可能造成机体损伤[7]。目前，检测食品中甜味剂的常用方法有：高效液相色谱法、高效离子色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、流动注射分析法、电化学法、光谱分析法等[8-9]，上述方法往往存在样品前处理过程复杂、分析时间长、准确度偏低等缺点。为了准确、快速地检测食品中的甜味剂，做到有效合理利用人工合成甜味剂，以确保食品安全和人类健康，作者对样品的前处理和上述甜味剂测定进行了深入研究，建立了检测5种甜味剂的HPCE法，旨在为HPCE同时检测食品中多种甜味剂提供一定的参考依据。该方法样品前处理简单、操作简易、分离效率高、分析速度快、线性关系好、线性范围宽、重现性好，定量测定5种食品中的上述甜味剂含量，结果令人满意。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器 P/ACETMMDQ毛细管电泳系统（Beckman Coulter，Fullerton，CA，USA），紫外-可见吸收检测器，内壁未涂层熔融石英毛细管（50 μm×75 cm，有效长度60 cm），32Karat电泳分析软件，均由河北永年锐沣色谱器件有限公司提供；FA/JA系列精密电子天平（精度：0.000 1 g），天津天马衡基仪器有限公司制造；KQ-100DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司制造；800型电动离心机，金坛市杰瑞尔电器有限公司制造；DZF-6050B型真空干燥箱，上海齐欣科技仪器有限公司制造；0.22 μm水相混合纤维素酯膜，上海半岛实业有限公司净化器材厂制造。

1.1.2 试剂 纽甜、阿斯巴甜、甜蜜素、糖精钠、安赛蜜标准样品（纯度>99%），美国Sigma公司产品；乙腈（色谱纯），江苏汉邦科技有限公司产品；浓HCl（分析纯），蚌埠市生原精细化工有限责任公司产品；三氯乙酸（分析纯），济南市荣盛化工有限公司产品；无水乙醇（分析纯），安徽安特食品股份有限公司产品；二次蒸馏水，“好吃点”、“西梅”、“亲嘴烧”、素牛味棒、草莓味酸奶，均购买于本地超市。

1.2 混合标准溶液的配制

将标准样品经100℃减压烘干4 h至恒质量后，分别准确称取纽甜5.5 mg、阿斯巴甜5.1 mg、甜蜜素12.7 mg、糖精钠 9.0 mg、安赛蜜40.3 mg于 10 mL容量瓶中，加适量二次蒸馏水完全溶解后再定容至刻度，混匀，得5种样品的原标准混合溶液。取上述原标准溶液分别稀释5倍、10倍、20倍、40倍、60倍，即得不同质量浓度系列的5种混合标准溶液；采用上述方法分别配制5种甜味剂的单一标准溶液，备用待分析。

1.3 样品处理

分别将固体食品“好吃点”、西梅、“亲嘴烧”、素牛味棒等食品粉碎，称取适量（准确至0.000 1 g），分别置于25 mL的比色管中，加1 mL无水乙醇，再加15 mL二次蒸馏水，超声振荡1 h，静置24 h，再超声振荡1 h，加水至刻度，4 000 r/min离心20 min，取上清液，经0.22 μm滤膜过滤，得滤液；取一定量的液体食品酸奶，采用3 mL 100 g/L的三氯乙酸除蛋白质[10-11]，过滤，得滤液。待分析。

1.4 实验方法

1.4.1 电泳条件 电泳毛细管：熔融石英毛细管75 cm（60 cm 处检测窗口）×50 μm；缓冲液：0.2 mol/L硼酸盐（pH=8.29）；分离电压+23kV，进样压力 3.45 kPa，进样时间3.0 s，分离温度25℃，UV-Vis检测器检测波长200 nm。每次电泳分析之前要依次运行如下冲洗程序：0.1 mol/L NaOH溶液冲洗1 min，0.1 mol/L HCl溶液冲洗1 min，二次蒸馏水冲洗1 min，缓冲溶液冲洗2 min。

1.4.2 标准曲线绘制及样品测定 分别取按1.2法配制的不同质量浓度系列的标准溶液，在上述选定电泳分离条件下进样测定分析，以峰面积（y）对相应的质量浓度（x）进行线性回归，作出标准曲线。实际样品经前处理后，按同样电泳条件进行分析。按标准曲线计算样品中各甜味剂含量。

1.5 数据处理

试验所得数据采用Origin 8.0软件处理、统计、分析、作图。

2 结果与讨论

2.1 电泳条件的优化

通过以下实验确定最佳电泳条件为：电泳缓冲溶液：0.2 mol/L 硼酸盐（pH=8.29）；分离电压+23 kV，UV-Vis检测器检测波长200 nm。文中未特别指明之处皆为此实验条件。实验步骤具体分析如下。

2.1.1 缓冲溶液pH值的选择 以电渗流（EOF）为驱动力的毛细管电泳法，其EOF对缓冲溶液的pH值十分敏感。因缓冲溶液pH值影响毛细管表面的ξ电势，进而影响EOF方向及大小；pH值也影响样品中各组分分子表面电荷数量，从而影响组分迁移速度及分离效果；pH值改变影响组分电离程度，影响其与管壁表面作用，影响组分的迁移速度，最终影响分离度[12]。因此，pH值对分离效果影响较大。本实验中考察了硼酸盐缓冲溶液pH值在7.34～10.00之间对组分迁移时间的影响，见图1。结果表明：当缓冲溶液pH=8.29时，分离效果最佳。

图1 不同缓冲液pH值下5种甜味剂电泳图Fig.1 Electrophoretograms of 5 kinds of artificial sweeteners at different pH values of buffer

2.1.2 分离电压的选择 在高效毛细管电泳中，分离电压是分离的动力，对分离度有较大影响。分离电压决定电场强度，而电场强度影响EOF大小及带电粒子迁移速率，从而决定组分迁移时间。本实验在+14～+29 kV范围内考察了分离电压对各组分迁移时间的影响，见图2。可知：分离电压越高，组分的迁移时间越短。当分离电压为+23 kV时，各组分均达到基线分离，且保留时间较短；当分离电压超过+23 kV时，虽各组分出峰时间较短，但分离度降低；当分离电压低于+23 kV时，分离度改变不明显，但由于电压较低造成的组分峰拖尾现象严重，不利于样品的精确定量分析。故选择+23 kV作为分离电压。

图2 不同电压下5种甜味剂电泳图Fig.2 Electrophoretograms of 5 kinds of artificial sweeteners in different voltages

2.1.3 检测波长的选择 采用紫外-可见吸收检测器分别对 200、214、254、280 nm等 4个检测波长进行考察，得电泳图。由图3知：254 nm和280 nm时，各组分吸收值均较低，不宜作为最佳检测波长；214nm时，虽安赛蜜对应电泳峰较高，但纽甜、阿斯巴甜、甜蜜素、糖精钠4组分电泳峰较低，不够灵敏，亦不宜作为最佳检测波长。甜蜜素由于本身无共轭结构，上述波长下紫外吸收均较弱，灵敏度较低。综合考虑，选择200 nm作为最佳检测波长。

图3 不同波长下5种甜味剂电泳图Fig.3 Electrophoretograms of 5 kinds of artificial sweeteners at different wavelengths

2.2 5种甜味剂的定性分析

分别取1.2中5种标准样品单一溶液和其混合溶液，在最佳电泳条件下测定，得电泳图。从图4可以看出，此5种甜味剂在11 min内能有效分离。出峰顺序依次为：纽甜、阿斯巴甜、甜蜜素、糖精钠、安赛蜜。

图4 最佳条件下5种甜味剂电泳图Fig.4 Electrophoretograms of 5 kinds of artificial sweeteners under optimal conditions

2.3 定量分析方法的建立

2.3.1 线性范围、检出限和定量限 根据各组分的峰面积（y）对相应的质量浓度（x）的线性回归标准曲线，得出回归方程、相关系数及线性范围；以各组分的信噪比S/N=3时相应质量浓度确定为最低检出限（LOD）；以各组分的信噪比S/N=10时相应质量浓度确定为最低定量限（LOQ），所得定量分析参数见表1。结果表明：5种组分在较宽范围内有良好的线性关系，能够满足定量分析的要求。

表1 定量分析参数（LOD，S/N=3）Table 1 Parameters of HPLC quantitative analysis （LOD，S/N=3）

2.3.2 重复性实验 采用1.2原混合标准溶液进行重复实验5次，求出相应电泳峰面积及均值，计算出相对标准偏差（RSD），所得结果见表 2。可知：5种甜味剂的RSD在3.81%～6.40%之间，精密度符合方法学要求，能够用于食品中上述甜味剂的定量分析。

2.3.3 加标回收率 准确称量一定质量的西梅，按照1.3样品处理方法处理，然后在测定线性范围内加入适量的5种甜味剂标准物质进样检测。连续分析5次，5种标准物质加标回收率测定结果见表3。结果表明：5种甜味剂的加标回收率在96.29%～102.31%，回收率适中，可用于食品中甜味剂的检测。

表2 重复性实验结果（n=5）Table 2 Results of repeated experiment（n=5）

表3 加标回收率结果（n=5）Table 3 Results of spiked recoveries（n=5）

2.4 5种样品中甜味剂含量的测定

分别对1.3所得5种样品溶液中的甜味剂进行定量分析检测，每种样品平行测定6次，所得电泳图见图5。根据所测峰面积及线性回归方程计算样品中甜味剂含量，其结果见表4。

3 结语

建立了同时测定食品中5种甜味剂的高效毛细管电泳法，该方法样品前处理简单、灵敏度高、准确可靠、精密度高，所得定量分析参数均能满足测定要求。通过实验分析，5种甜味剂的加标回收率为96.29%～102.31%，相对标准偏差为3.81%～6.40%，表明此方法能够满足食品中多种甜味剂的同时检测，操作简捷易行。

图5 5种甜味剂加标回收率电泳图Fig.5 Electrophoretograms of 5 kinds of artificial sweeteners for spiked recoveries

表4 5种食品中甜味剂测定结果（n=6）Table 4 Determination results of sweeteners in 5 samples（n=6）

[1]董亚蕾，陈晓姣，胡敬，等.高效毛细管电泳在食品安全检测中的应用进展[J].色谱，2012，30（11）：1117-1126.DONG Yalei，CHEN Xiaojiao，HU Jing，et al.Recent advances in the application of high performance capillary electrophoresis for food safety[J].Chinese Journal of Chromatography，2012，30（11）：1117-1126.（in Chinese）

[2]高文惠，杨桂君.毛细管电泳法测定食品中8种添加剂[J].食品科学，2010，31（18）：377-380.GAO Wenhui，YANG Guijun.Determination of eight food additives in different matrices by capillary electrophoresis[J].Food Science，2010，31（18）：377-380.（in Chinese）

[3]郑鹏然，周树南.食品卫生全书[M].北京：红旗出版社，1996：642-643.

[4]高文惠，裴红，杨桂君.毛细管电泳在食品添加剂检测中的应用[J].食品与生物技术学报，2010，29（3）：326-330.GAO Wenhui，PEI Hong，YANG Guijun.The application of capillary electrophoresis in food additive detection[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2010，29（3）：326-330.（in Chinese）

[5]Galletti Guido C，Bocchini Paola.High-performance liquid chromatography with electrochemical detection of aspartame with a post-column photochemical reactor[J].Journal of Chromatography A，1996，729（1/2）：393-398.

[6]中华人民共和国卫生部.GB 2760—2011食品安全国家标准/食品添加剂使用标准[S].北京：中国标准出版社，2011.

[7]蒋晓彤，陈国松，姜玲玲，等.高效液相色谱法同时检测6种甜味剂[J].食品科学，2011，32（6）：165-168.JIANG Xiaotong，CHEN Guosong，JIANG Lingling，et al.Simultaneous HPLC determination of 6 sweeteners[J].Food Science，2011，32（6）：165-168.（in Chinese）

[8]杨大进.食品中甜味剂和合成防腐剂的检测方法及保健食品限量标准的研究[D].长沙：湖南师范大学，2009.YANG Dajin.Study on analytical methods of sweeteners and synthetic preservatives in foods and limits standard in health foods[D].Changsha：Hunan Normal University，2009.（in Chinese）

[9]鲁琳，杭义萍，高燕红，等.食品甜味剂分类及其检测技术现状[J].现代预防医学，2009，36（11）：2033-2035.LU Lin，HANG Yiping，GAO Yanhong，et al.Classification of food sweeteners and the status quo of its detection technology[J].Modern Preventive Medicine，2009，36（11）：2033-2035.（in Chinese）

[10]丁晓静，杨媛媛，李芸，等.原料奶、婴儿配方奶粉及酸奶中蛋白质去除效果的研究[J].分析化学，2010，38（1）：77-81.DING Xiaojing，YANG Yuanyuan，LI Yun，et al.Investigation of removal of proteins in raw milk，infant formula and yogurt[J].Chinese Journal of Analytical Chemistry，2010，38（1）：77-81.（in Chinese）

[11]龚强，丁利，朱绍华，等.高效液相色谱-串联质谱法检测乳制品中10种氨基糖苷类抗生素残留 [J].色谱，2012，30（11）：1143-1147.GONG Qiang，DING Li，ZHU Shaohua，et al.Determination of ten aminoglycoside residues in milk and dairy products using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Chinese Journal of Chromatography，2012，30（11）：1143-1147.（in Chinese）

[12]XUE Hongbao，JIAO Yanna，LI Hui.Capillary electrophoresis separation of the six pairs of chiral pharmaceuticals enantiomers[J].Asian Journal of Chemistry，2013，25（5）：2742-2746.