微波辅助提取和田玉枣环磷酸腺苷的工艺及与其他方法比较

王立霞

（陕西学前师范学院，陕西 西安 710100）

环磷酸腺苷 （简称 cAMP，Adenosine 3′，5′-cyclic monophosphate）1957年由 Sutherland发现，它普遍存在于哺乳动物体内，控制并调节细胞新陈代谢[1-3]。医学研究证实，至少40多种疾病（癌症、冠心病、心源性休克、高血压和心肌梗死等重大疾病）与cAMP代谢有关，人体缺乏cAMP或cAMP/cGMP值下降，会导致众多疾病的发生。cAMP是枣中重要活性物质[4-5]。据报道，枣成熟果肉中cAMP含量为一般动植物的数千至数万倍，具有重要开发价值[6-7]。目前，已有关于cAMP在保健食品领域应用的报道[8]。我国枣园面积已达150多万公顷，产量200万t，新疆和田地区凭借其独特资源优势，近年枣业发展迅速，面积达30多万公顷[9]。作者已对不同产地、不同含水量、不同组织骏枣、灰枣中cAMP含量进行了研究并得出结果，和田玉枣（山西省交城县骏枣引种于和田后其商品名称为和田玉枣）中cAMP含量相对最高。

微波辐射过程是高频电磁波穿透萃取介质，达到物料内部维管束和腺胞系统，胞内温度迅速上升，细胞膨胀破裂，胞内有效成分自由流出，在较低的温度下提取介质。利用微波可更快、更均衡地加热材料，并且实现更高的产量和有更干净的反应物。关于cAMP的提取方法，作者已对传统溶剂提取法进行了研究，本研究中引入了微波辅助提取法，并对传统溶剂提取法和微波辅助提取法进行对比，以获取微波辅助提取和田玉枣cAMP的最优工艺参数。本研究成果为和田玉枣及其它枣品种cAMP的深入研究及开发利用提供了参考及理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新疆和田玉枣，2012年10月采摘后烘干枣，枣去核经40℃干燥，粉碎过60目筛，室温下密封保存；cAMP标品（纯度≥99%），色谱纯，德国Sigma公司生产；甲醇 （纯度99.8%），色谱纯，加拿大Promptar公司生产；其余试剂为国产分析纯。LS-200型大孔吸附树脂，西安蓝深特种树脂有限公司生产。

1525型高效液相色谱仪，Waters公司制造；TDL-5型低速大容量离心机，上海安亭科学仪器有限公司制造；UV2550型紫外可见分光光度计，Shimadzu公司制造；WD780BS微波炉，格兰仕电器有限公司制造。

1.2 实验方法

1.2.1 高效液相色谱检测条件 色谱柱：Brava-BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱；流动相：甲醇-双蒸水（pH 为 3）（体积比 10∶90）；体积流量 0.8 mL/min，紫外全波长扫描（如图1所示）确定检测波长257.0 nm，室温，进样量 20 μL[10-12]。

图1 cAMP标准品扫描图谱Fig.1 Scanning images of standard cAMP

1.2.2 cAMP标品溶液的制备及标准曲线的制作精密称取cAMP标品2.5 mg，置50 mL容量瓶，加流动相至刻度，摇匀，得0.05 mg/L cAMP标品溶液。分别吸标品溶液 1、2、3、4、5、6、7、8 mL 于 10 mL 容量瓶，加流动相至刻度，摇匀，得 5、10、15、20、25、30、35、40 μg/mL 系列标品溶液，分别吸 20 μL 系列标品溶液入色谱仪[13-14]，记录色谱图，以浓度为横坐标，以cAMP峰面积为纵坐标线性回归，得线性方程

1.2.3 乙醇体积分数对枣cAMP提取量的影响实验准确称取和田玉枣粉2 g（按1.1中所介绍方法制得），以料液比1∶15[9]分别溶解于体积分数5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%的乙醇溶液，常温浸泡8 h，300 W功率微波处理1 min，所得溶液离心、过滤、真空浓缩后用双蒸水定容，过0.45 μm滤膜，进样分析，保留时间法定性。如图2所示，样品峰与标品峰的保留时间几乎一致，分别为8.253min和8.297 min，以后均按此法进行检测[15-16]。峰面积外标法定量[8-9]，测不同体积分数乙醇中提取物的提取量（μg/g）。

图2 样品及标品中cAMP色谱图Fig.2 Chromatogram of cAMP in jujube sample and standard cAMP

1.2.4 微波提取条件对枣cAMP提取量的影响实验影响微波辅助提取效果的主要因素有微波功率、微波时间、浸泡时间及液料比，对上述4因素进行单因素实验，并在此基础上进行正交实验，确定最佳提取工艺参数[17-21]。在进行微波辅助法提取的同时，与超声波辅助法及传统溶剂法进行对比。

1）微波功率对枣cAMP提取量的影响实验：准确称取和田玉枣粉2 g，以料液比1∶15加入体积分数10%乙醇溶液，常温浸泡8 h，分别在100、200、300、400、500、600 W 功率下微波处理 1 min[22]。分别测定（方法见 1.2.3，下同）cAMP 提取量（μg/g），确定最佳提取功率。

2）微波时间对枣cAMP提取量的影响实验：准确称取和田玉枣粉2 g，以料液比1∶15加入体积分数10%乙醇溶液，常温浸泡8 h，300 W功率分别微波处理 1、2、3、4、5、6 min[23]。分别测定 cAMP 提取量（μg/g），确定最佳提取时间。

3）浸泡时间对枣cAMP提取量的影响实验：准确称取和田玉枣粉2 g，以料液比1∶15加入体积分数 10%乙醇溶液， 分别常温浸泡 0、2、4、6、8、10 h，300 W功率微波处理 3 min[24]。分别测定cAMP提取量（μg/g），确定最佳浸泡时间。

4）液料比对枣cAMP提取量的影响实验：准确称取和田玉枣粉 2 g， 分别以料液比 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 加入体积分数 10%乙醇溶液，常温浸泡6 h，以300 W功率微波处理3 min。分别测定cAMP提取量（μg/g），确定最佳料液比。

5）正交实验：在单因素实验基础上对微波功率、微波时间、浸泡时间、料液比采用L9（34）正交实验进行优选，以确定最佳微波工艺。因素水平设计见表1[25]。

表 1 L9（34）实验因素水平表Table 1 L9（34） Orthogonal factor level table

1.2.5 和田玉枣cAMP的分离效果实验 用LS-200型大孔吸附树脂做动态吸附及解吸实验[11]，计算和田玉枣cAMP的分离效率。

1）泄露曲线的研究试验：准确称取25 mL处理好的LS-200型树脂装玻璃层析柱，将和田玉枣粉以1∶15料液比加入体积分数10%乙醇溶液，按照2.2.5中最优条件提取cAMP，过滤后真空浓缩，调整质量浓度为30 μg/mL，pH为4，进行动态吸附[11]：上样体积流量1 mL/min，其间每管收集20 mL，过0.45 μm滤膜，进样分析，测流出液浓度，至流出液浓度与上样液浓度相同时停止上样，做泄露曲线，确定最佳上样体积。

2）LS-200型树脂的洗脱曲线：准确称取25 mL处理好的LS-200型树脂装玻璃层析柱，量取160 mL和田玉枣cAMP上样液，调整质量浓度为30 μg/mL，pH为4，以1 mL/min体积流量上柱吸附。先用蒸馏水洗脱，每50 mL收集一份，再用体积分数35%乙醇洗脱，每20 mL收集一份，分别将洗脱液于50℃下真空浓缩除去溶剂，用蒸馏水定容于25 mL容量瓶中，过0.45 μm滤膜，进样分析，计算其cAMP含量，做洗脱曲线，并将洗脱液真空浓缩后冷冻干燥，测定其纯度。

2 结果与分析

2.1 乙醇体积分数对枣cAMP提取量的影响

乙醇体积分数对枣cAMP提取量的影响见图3。可见，随着乙醇体积分数增大，cAMP提取量先增大后缓慢减小。在乙醇体积分数为15%时，cAMP提取量达到最高，为570.33 μg/g，仅比乙醇体积分数10%时高1 μg/g，考虑能量节省及减少污染等因素，乙醇体积分数以10%为宜。

图3 乙醇体积分数对cAMP提取量的影响Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on extracting content of cAMP

2.2 微波提取条件对枣cAMP提取量的影响

2.2.1 微波功率对枣cAMP提取量的影响 微波功率对枣cAMP提取量的影响见图4。由图可见，cAMP提取量随微波功率的增大而先增大后缓慢减小，当微波功率为300 W时，cAMP提取量最高为571.23 μg/g，故选择微波提取功率300 W为宜。

图4 微波功率对cAMP提取量的影响Fig.4 Effect of power of microwave wave on extracting content of cAMP

2.2.2 微波时间对枣cAMP提取量的影响 提取时间对枣cAMP提取量的影响见图5。由图可见，cAMP提取量随微波时间的延长而先增大后缓慢减小，当微波时间为3 min时，cAMP提取量最高为590.89 μg/g，故选择微波提取时间3 min为宜。

2.2.3 浸泡时间对枣cAMP提取量的影响 浸泡时间对枣cAMP提取量的影响见图6。可见，cAMP提取量随浸泡时间的延长而先增大后减小，这是由于适当浸泡可促进细胞中cAMP的溶出，但浸泡时间过长，cAMP又发生改变，当浸泡时间为6 h时，cAMP提取量最高为621.35 μg/g，故选择浸泡时间6 h为宜。

图5 微波时间对cAMP提取量的影响Fig.5 Effect of microwave time on extracting content of cAMP

图6 浸泡时间对cAMP提取量的影响Fig.6 Effect of soak period on extracting content of cAMP

2.2.4 料液比对枣cAMP提取量的影响 料液比对枣cAMP提取量的影响见图7。可见，cAMP提取量随料液比的增大而先增大后趋于一致，当料液比为 1∶25 时，cAMP 提取量最高为 651.65 μg/g， 故选择料液比1∶25为宜。

图7 料液比对cAMP提取量的影响Fig.7 Effect of liquid-solid ratio on extracting content of cAMP

2.2.5 正交实验 按L9（34）进行正交实验，数据处理及结果见表2，方差分析见表3。由极差分析可知，各因素对cAMP提取量影响的大小顺序为：微波时间＞微波功率＞料液比＞浸泡时间。微波辅助提取和田玉枣cAMP最优工艺组合为A2B2C2D3，即微波功率300 W、微波时间3 min、浸泡时间6 h、料液比1∶30。由表3方差分析知，微波功率、微波时间、浸泡时间、料液比差异显著。

表2 正交实验结果Table 2 Result of orthogonal experiment

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis table

2.2.6 验证实验 正交实验中提取量最高的组合为A2B2C3D1，正交表分析得出最佳组合为A2B2C2D3，对两组工艺进行验证实验，分别重复3次，取平均值。结果表明，最优组合A2B2C2D3的cAMP提取量为 795.63 μg/g，组合 A2B2C3D1提取量为723.59 μg/g，因此微波辅助提取和田玉枣cAMP最优工艺条件为微波功率300 W、微波时间3 min、浸泡时间6 h、料液比 1∶30。

2.3 提取方法比较

采用传统溶剂法[9]、超声波辅助法[11]提取和田玉枣cAMP，并与2.2.5中微波辅助法最优工艺进行对比。3种方法工艺条件及实验结果见表4。可见，微波辅助法（提取量795.63 μg/g）明显优于传统溶剂法（620.28 μg/g），优于超声波辅助法（771.95 μg/g）。由于微波功率及微波时间短，故能耗少于超声波辅助法。

表4 3种提取方法比较Table 4 Comparison of different extraction methods

2.4 和田玉枣cAMP分离纯化效果

2.4.1 泄露曲线 LS-200型树脂对和田玉枣cAMP的泄露曲线见图8。可见，上样160 mL，即第8份收集液以后流出液中cAMP含量开始升高，故将其确定为漏点。确定LS-200型树脂最大上样体积160 mL，即6.4倍树脂体积。

图8 LS-200型树脂对和田玉枣cAMP的泄露曲线Fig.8 Leak curve of LS-200 resint adsorb cAMP from Hetianyuzao

2.4.2 LS-200型树脂洗脱曲线 LS-200型树脂洗脱曲线见图9。可见，水洗过程中极少量cAMP洗脱下来，不影响cAMP得率。同时，HPLC色谱图中发现大量杂质被洗脱下来，第4份水洗物中吸收峰已很少，故确定脱除杂质水洗体积200 mL（8倍树脂体积）。35%乙醇洗脱第一份时，即有cAMP检出，收集至第6份时，洗脱液几乎不含cAMP，故确定体积分数35%乙醇洗脱剂为120 mL，即4.8倍树脂体积。

图9 洗脱曲线Fig.9 Washing curve

经计算和田玉枣cAMP分离效率为97.81%。洗脱过程发现，颜色最重流份中cAMP含量最高，没有颜色流份中几乎不含cAMP，说明cAMP和色素结合在一起，故得到cAMP粗品纯度不高，为3.47%。粗品色谱图见图10

图10 和田玉枣cAMP粗品色谱图Fig.10 Chromatogram of cAMP in Hetianyuzao crude sample

3 结语

经单因素及正交实验分析，确定微波辅助提取和田玉枣cAMP的最优工艺条件：乙醇体积分数10%，微波功率300 W，微波时间3 min，浸泡时间6 h，料液比1∶30。在此工艺条件下，和田玉枣cAMP平均提取量为795.63 μg/g；影响和田玉枣cAMP提取量的各因素显著顺序为：微波时间＞微波功率＞料液比＞浸泡时间。

通过对3种提取方法的比较，得知微波辅助法较传统溶剂法提取量高，提取时间短；较超声波辅助法提取量高，能耗低。

采用LS-200型树脂分离纯化和田玉枣cAMP的分离效率为97.81%。cAMP粗品纯度为3.47%。

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