西妥昔单抗联合奈达铂对宫颈癌Hela细胞增殖的影响*

邓克红，王晨阳，王武亮

郑州大学第二附属医院妇产科 郑州450014

#通讯作者，男，1963年11月生，本科，主任医师，研究方向:妇科肿瘤，E-mail:wangwuliang888@sina.com

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。近20年来，发病率呈现年轻化特点。由于传统手术和放疗对患者生活质量的影响不可逆，所以宫颈癌化疗受到了越来越多的关注［1］。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)在很多实体瘤包括宫颈癌中都有过量表达［2］，与肿瘤细胞的恶性生物学特征和预后密切相关［3］。EGFR 抑制剂已成为靶向治疗的热点。西妥昔单抗(cetuximab，C225)是常见的特异性EGFR 抑制剂，临床上已经用于晚期头颈部鳞癌和直肠癌的治疗，并取得了满意的疗效。奈达铂(nedaplatin，NDP)属第二代有机铂类，其剂量限制毒性是血小板减少，部分患者因发生严重的血小板下降而导致化疗停止［4］;临床上已试图寻找NDP 增敏药物或联合用药以增强其疗效，降低其毒副作用。有临床研究［5］提出EGFR 特异性抑制剂C225 可增敏化疗药物的细胞杀伤作用，但C225与NDP 联用的疗效国内尚未见报道。该实验旨在探讨C225、NDP 单用及两药联合应用对人宫颈癌Hela 细胞增殖作用的影响，为C225 在宫颈癌中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及主要试剂 Hela 细胞株(购自郑州创生生物工程有限公司)用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640 培养液在37℃、含体积分数5%CO2的培养箱培养，2.5 g/L 胰蛋白酶原消化传代。C225 购自长沙市康来医药公司，NDP 购自江苏奥赛康药业有限公司。

1.2 C225 对Hela 细胞增殖的抑制作用 取对数生长期细胞制成单细胞悬液，细胞密度调至(4～5)×106mL－1。按每孔100 μL 接种在96 孔板上，置于37℃培养箱中培养24 h，细胞全部贴壁后，弃去孔内的培养液，依实验分组加入100 μL 不同质量浓度(10、20、40、60、80 和160 mg/L)的C225 和100 μL RPMI 1640，总体积200 μL。每个质量浓度设5 个复孔(阴性对照为单细胞悬液)。继续分别培养24、48 和72 h。在相应时间点每孔加入20 μL MTT 继续培养4 h，弃去上清液后每孔加入200 μL二甲基亚砜(DMSO)，置于摇床上低速振荡10 min。在自动酶标读数仪上选择波长490 nm，空白组调零，测各孔的OD 值，并计算细胞增殖抑制率。实验重复5 次。计算公式为:细胞增殖抑制率=(1 －实验组平均OD 值/对照平均OD 值)×100%。

1.3 NDP 对Hela 细胞增殖的抑制作用 按1.2的方法培养细胞，用不同质量浓度(1、5、10、20、40和60 mg/L)NDP 分别培养24、48 和72 h，用MTT法测细胞增殖抑制率。

1.4 40 mg/L C225 联合不同质量浓度NDP 对Hela 细胞增殖的抑制作用 按1.2 的方法培养细胞。将C225 质量浓度定为40 mg/L，分别与奈达铂(1、5、10、20、40 和60 mg/L)联合处理细胞，设空白组、对照组，每组分别培养24、48 和72 h 后用MTT法测细胞增殖抑制率。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0 进行分析，应用6×3 析因设计的方差分析比较C225、NDP 单药及联合用药不同质量浓度及不同时间对宫颈癌Hela细胞抑制作用的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 C225 单药对宫颈癌Hela 细胞的增殖抑制作用 见表1。由表1可以看出，随着C225 质量浓度的增加和作用时间的延长，细胞增殖抑制率的变化差异无统计学意义。

表1 C225 对宫颈癌Hela 细胞的增殖抑制率(n=5)%

2.2 NDP 单药对宫颈癌Hela 细胞的增殖抑制作用 见表2。由表2可以看出，随着NDP 质量浓度的增加和作用时间的延长，细胞的增殖抑制率逐渐增加。

表2 NDP 单药对宫颈癌Hela 细胞的增殖抑制率(n=5)%

2.3 C225 联合NDP 对宫颈癌Hela 细胞的增殖抑制作用 由于各质量浓度的C225 对Hela 细胞增殖抑制作用差异无统计学意义，故根据临床经验选择质量浓度为40 mg/L C225 联合不同质量浓度NDP作用于Hela 细胞，24、48 和72 h 后的细胞增殖抑制率见表3。从表3可以看出，C225 联合NDP 用药对细胞增殖的抑制率明显高于对应的C225 或NDP单药。

表3 40 mg/L C225 联合不同质量浓度NDP 对宫颈癌Hela 细胞的增殖抑制率(n=5)%

3 讨论

EGFR 广泛地存在于正常人体的细胞表面，配体与其结合后调控细胞的生理过程，在正常细胞的生长、增殖、分化及凋亡过程中发挥着重要的功能。EGFR 基因的突变和EGFR 的异常高表达可以在多种实体恶性肿瘤中检测到［2］，如宫颈癌、卵巢癌、直肠癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤等。EGFR 蛋白的异常高表达促使肿瘤细胞活化，长期处于无限增殖状态，是肿瘤形成的重要原因之一［6］。有研究者［4］提出，EGFR 在宫颈癌中阳性表达者占60%～90%，且EGFR 的高表达与宫颈癌的复发及预后密切相关。并且EGFR 蛋白的异常高表达可增加肿瘤细胞粘附于细胞外基质，增加肿瘤细胞降解基底膜、血管形成及远处转移的机会［7］。特异性的EGFR 靶向药物目前主要有两种:一种是小分子酪氨酸激酶(EGFR-TK)抑制剂，可促进凋亡［8］，代表药物是易瑞沙;另一种是单克隆抗体，主要作用于EGFR 位于细胞外的配体结合区，竞争性地抑制受体与配体的结合，阻断受体激活途径，代表药物是C225。临床上，C225 已经用于某些肿瘤如直肠癌、头颈部肿瘤等的治疗，并且取得了较好的疗效。但关于C225 对宫颈癌的疗效，国内外研究较少。作者通过体外实验研究显示C225 单药对宫颈癌Hela 细胞增殖无明显抑制作用。可能原因是C225 的主要抗癌机制并不是直接作用于肿瘤细胞，由于肿瘤组织内细胞与细胞间存在复杂的细胞应答反应，体外细胞培养缺少细胞间的相互作用和影响，C225 可能通过直接或间接影响肿瘤细胞血管生成、细胞粘附及增殖能力而发挥抗肿瘤作用。

临床上，NDP 对宫颈癌、头颈癌、非小细胞肺癌、食管癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤有效。NDP 与顺铂相比，胃肠道反应轻，肾毒性和神经毒性小，患者的总生存率与顺铂相同，但有提高趋势［4］。Koshiyama 等［9］提出，在临床前研究中，与顺铂的抗肿瘤活性相比，NDP 更好。但NDP 的剂量限制毒性是骨髓抑制导致的血小板减少，部分患者发生严重的血小板下降导致化疗停止［4］。该实验研究显示，NDP 对Hela 的增殖抑制作用呈现明显的质量浓度和时间依赖，与文献［10］报道基本一致。

有研究报道靶向药物和化疗药物因不同的抗肿瘤作用机制，故没有重复交叉细胞毒作用，还可在增加彼此疗效的同时降低各自用药剂量，并降低了对正常细胞的毒副作用。研究［11］表明，C225 与化疗药物联合应用疗效要优于单纯化疗。该研究结果显示C225 联合NDP 后，细胞增殖抑制率明显增加，明显高于C225 单药或NDP 单药，且呈现质量浓度和时间依赖，说明C225 能增敏Hela 细胞对NDP 的反应。当NDP 的质量浓度较低时，C225 增敏作用较明显，随着NDP 质量浓度逐渐增加，联合用药时细胞增殖抑制率增幅较浓度低时减弱。该研究属体外实验，还缺乏生物体内复制的细胞与细胞间反应和调节机制的研究，需要体内试验进一步深入探索。

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