子宫平滑肌瘤组织中孕激素受体和porin mRNA的表达

封全灵，刘弘扬

郑州大学第三附属医院妇产科 郑州450052

△女，1965年4月生，博士，主任医师，研究方向:妇科肿瘤，E-mail:zzufql@126.com

孕激素促进子宫平滑肌瘤生长的确切机制尚不清楚。传统观念认为子宫平滑肌瘤的形成和生长主要与孕激素核内受体发挥的基因组作用有关，而越来越多的研究［1］表明孕激素还可以通过核外孕激素受体(progesterone receptor，PR)发挥快速的非基因组作用。PR-M 是2003年发现的定位于线粒体外膜的PR［2］，它在孕激素诱导下使得线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)增加，从而抑制原代培养、永生化子宫平滑肌细胞和乳癌细胞的凋亡［3-4］。研究［5］表明PR-M 的分布与线粒体有关，在子宫平滑肌、心脏和肝脏中均高表达。porin蛋白是参与形成线粒体外膜小孔的线粒体标志性蛋白，调节能量代谢和细胞凋亡［6-7］。作者采用RTPCR 方法分别检测PR-M 和porin mRNA 在子宫平滑肌瘤及肌瘤旁正常平滑肌组织中的表达情况，同时检测相应标本中传统孕激素受体PR-A、PR-B mRNA 的表达，分析3 种PR 与porin 表达的相关性，探讨其参与子宫平滑肌瘤发生发展的机制。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2012年10月至12月于郑州大学第三附属医院妇产科因子宫平滑肌瘤行子宫切除术的患者28例，年龄39～57(45.8±3.9)岁。患者均无其他合并症，术前至少半年未服用类固醇激素，通过末次月经时间和病理证实患者子宫内膜均处于增殖期。术中取平滑肌瘤组织标本为研究组，取相应瘤旁正常子宫平滑肌组织为对照组。标本均经病理证实，该研究获得患者知情同意。

1.2 PR 和porin mRNA 的检测 采用RT-PCR 方法。取新鲜离体组织1 g，－80℃低温冻存。Trizol试剂盒、逆转录酶、Taq 酶、dNTP 及分子量标准均购自北京全式金生物技术有限公司;PR-A、PR-B、PR-M和线粒体porin RT-PCR 引物由郑州宝科生物科技公司合成，引物序列见表1。首先提取总RNA 并逆转录，然后进行PCR。扩增条件为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环;72℃延伸10 min。产物采用20 g/L 琼脂糖凝胶电泳后显色，以目的基因与内参β-actin 灰度值比值作为目的基因的相对表达水平。

表1 引物序列

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0 对数据进行统计分析。2组PR-M、PR-A、PR-B 与porin mRNA 表达水平的比较采用配对t 检验。PR-M、PR-A、PR-B与porin mRNA 表达水平之间的关系采用Pearson 积差相关分析评价，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 2组PR-M、PR-A、PR-B 和porin mRNA 表达的比较 见图1和表2。

图1 对照组(1)和研究组(2)PR-A、PR-B、PR-M 和porin mRNA 的表达

表2 2组PR-M、PR-A、PR-B 和porin mRNA 表达水平的比较

2.2 相关性分析 见表3。研究组PR-M 与porin mRNA 的表达呈正相关。

表3 PR-M、PR-A、PR-B 与porin mRNA 相关性分析结果

3 讨论

3.1 PR-M 在子宫平滑肌瘤组织中的表达 PR 属于配体激活核转录因子超家族成员，传统PR 主要指PR-A 和PR-B，分布于胞核和胞浆。近些年来发现了一些新型PR，如PR-C、PR-M 和PR-T 等。PRM 是2002年从人主动脉细胞和脂肪组织cDNA 文库中克隆到的定位于线粒体外膜的PR，含有314 个氨基酸，cDNA 约为2 230 bp。同PR-A 和PR-B 相比，PR-M 含有激素结合结构域和铰链区，缺乏氨基末端A/B 结合域、DNA 结合结构域和核定位信号区，所以是一种截短的PR。PR-M 氨基末端的16 个氨基酸构成序列中包含的线粒体定位序列与其独特的线粒体定位功能有关。已有研究［3］表明PR-M 在人子宫平滑肌瘤和正常子宫平滑肌中均有表达，并且子宫平滑肌瘤组织中表达高于正常子宫平滑肌。该研究结果显示，人子宫平滑肌瘤和瘤旁正常子宫平滑肌组织中均存在PR-M mRNA，并且子宫平滑肌瘤组织中的表达高于正常子宫平滑肌组织，表明PR-M 在子宫平滑肌瘤生长过程中发挥促进作用。子宫平滑肌瘤组织中PR-A 和PR-B mRNA 表达较高，与报道［8］相一致，再次证实孕激素可以通过基因组效应在肌瘤组织中发挥作用。

3.2 线粒体外膜孔蛋白porin mRNA 的表达 线粒体外膜孔蛋白porin 也称电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channels，VDAC)，是形成线粒体外膜小孔的主要蛋白成分［6］。VDAC 通过调节线粒体和胞浆之间的离子交换，参与肿瘤、心脏病和神经变性疾病等多种疾病的发生［9］，可作为线粒体外膜的标志蛋白［10］。该研究结果表明，porin mRNA 在子宫平滑肌瘤组织中的表达明显高于瘤旁正常子宫平滑肌组织，提示肌瘤组织细胞线粒体功能较邻近平滑肌组织活跃。

3.3 子宫平滑肌瘤中3 种PR 和porin mRNA 的关系 采用孕激素或者PR 激动剂R5020 分别处理MCF-10A 细胞(缺乏核PR 表达的良性乳腺细胞，表达PR-M)和人永生化子宫平滑肌细胞，发现细胞MMP 增加，与细胞内ATP 水平增高一致，这种作用可以被PR 拮抗剂抑制，却不受基因转录抑制剂放线铜菌的影响［3-4］，提示孕激素通过PR-M 非基因组作用增加能量代谢。另外有证据［11］表明PR-B 可以通过非基因组作用介导Src 激酶的活化，激活MAPK 途径，进而诱导生物学效应。该研究结果显示，子宫平滑肌瘤组织中PR-M 与porin mRNA 表达水平呈正相关，PR-A、PR-B 与porin mRNA 无相关性。另外，曾有研究［3］从蛋白水平上证实子宫平滑肌瘤组织中PR-M 与porin 表达呈正相关。由此推断PR-M 在平滑肌瘤组织中的表达升高可能与线粒体外膜功能活跃有关，PR-M 可能通过非基因组作用影响线粒体外膜功能，加强细胞呼吸并抑制线粒体途径调节的细胞凋亡，从而参与子宫平滑肌瘤的发生发展。

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