肺癌组织中SOX2和β-catenin蛋白的表达

谢爱民，胡建明，陈 艰，孙黄涛，林 庆，陈美芳，陈梅花

江西省人民医院心胸外科南昌330000

△男，1970年12月生，硕士，副主任医师，研究方向:心胸外科临床，E-mail:xieaimin1998@126.com

肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一［1］。过去人们普遍认为，肺癌起源于支气管上皮和肺泡上皮，但是，肿瘤干细胞理论却提出:肺癌干细胞是肺癌发生的根源，肺癌的复发、侵袭、转移、耐放化疗、抗辐射等恶性表型特征均与之密切相关。肺癌干细胞具有自我更新和无限增殖的能力［2-3］，另外还具有很强的成瘤和耐受铂类化疗药物的能力［4］。Wnt/β-catenin 信号通路的紊乱与肿瘤的发生密切相关［5］，在许多肿瘤组织中都发现了该通路的异常表达;最近研究还发现，其在维持肿瘤干细胞的特性如肿瘤干细胞的数量、耐药性、克隆形成能力、体内成瘤性等方面也有着重要作用［6］。SOX2 作为全能性或多能性干细胞标记物，是维持干细胞未分化状态、增殖、不均分裂等的关键因子之一。近年来的文献［7-8］报道，SOX 基因的异常表达与许多疾病的发生发展有关系，尤其与许多人类肿瘤的发生密切相关。作者通过检测肺癌组织中干细胞因子SOX2 及β-catenin 蛋白的表达，探讨SOX2 及Wnt/β-catenin信号通路在肺癌发生中的作用机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取江西省人民医院心胸外科2008年2月至2011年9月经手术切除并经由病理确诊的肺癌患者86例，其中男52例，女34例，年龄38～75(56.7±4.5)岁。以正常开胸取得的其他疾病患者的肺正常组织20例作对照。患者术前均未接受过放疗和化疗，肝肾功能正常，排除孕妇、哺乳期妇女、精神病患者等。标本取出后立即经体积分数10%甲醛固定，常规石蜡包埋后封存。

1.2 主要试剂 小鼠抗人SOX2 多克隆抗体购自Santa Cruz 公司，兔抗鼠β-catenin 抗体购自上海信然生物技术有限公司;小鼠超敏免疫组化检测试剂盒(PV-9000)购自伊莱瑞特生物科技有限公司;胎牛血清、DAB 显色剂购自武汉御和生物技术有限公司。

1.3 标本中SOX2、β-catenin 蛋白的检测 无菌条件下取组织蜡块连续切片，片厚4 μm，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，体积分数3%过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶，PBS 缓冲液洗片，以EDTA 抗原修复液高压修复抗原，冷却，分别滴加SOX2 一抗(稀释度为1 ∶100)、β-catenin 一抗(稀释度为1 ∶1 600)，37℃孵育30 min 后4℃过夜，滴加兔抗小鼠二抗，采用小鼠超敏免疫组化检测试剂盒，室温孵育2 h，PBS 冲洗，DAB 显色。以PBS 代替一抗作空白对照，采用试剂公司提供的阳性组织切片作阳性对照。

1.4 结果判定 细胞内出现棕黄色颗粒即定为阳性细胞。每张切片选取具有代表性的肿瘤区域在高倍镜下选择5 个以上视野，计数1 000 个肿瘤细胞，计算阳性细胞百分率，坏死区和血管内皮细胞不计算在内。

1.5 统计学处理 数据采用SPSS 13.0 进行统计分析，2组间SOX2 和β-catenin 蛋白阳性表达率的比较采用精确概率法或χ2检验，肺癌组织中两种蛋白表达的关联性用列联系数来评估，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 肺癌及正常肺组织中SOX2 及β-catenin 蛋白的表达 SOX2 蛋白在肺癌组织中呈阳性表达，多数在细胞核表达，细胞质也有表达;正常肺组织中未见阳性表达。β-catenin 蛋白大量表达于肺癌组织的细胞核，在正常肺组织细胞核中少量表达。见图1、表1。

2.2 肺癌组织中SOX2 与β-catenin 蛋白表达的关联性 肺癌组织中SOX2 与β-catenin 蛋白的表达无关联性，见表2。

表1 2 种肺组织中SOX2、β-catenin 蛋白的表达例(%)

表2 肺癌组织中SOX2 与β-catenin 蛋白表达的关系

图1 肺癌及正常肺组织中SOX2、β-catenin 蛋白的表达(免疫组化染色法，×400)

3 讨论

Wnt/β-catenin 信号通路参与了胚胎发育、细胞增殖、细胞分化等正常生理过程［9］。Wnt 信号通路被异常激活与许多人类肿瘤的发生发展相关，包括胶质瘤、结肠癌、乳癌、肝癌等，Wnt 信号在干细胞自我更新和增殖分化功能的保持中有着举足轻重的作用，该信号途径各组件突变的终点是干细胞区域的不适当扩增和其分化的子代的增殖，最终在获得其他变异的情况下导致恶性事件的发生，形成侵袭性肿瘤细胞，是多种恶性肿瘤发生的重要原因［10］。SOX 基因是经典Wnt 信号通路的调控因子，SOX2是SOX 家族成员之一，在维持干细胞的多能性、增殖、保持不分化状态、细胞不均等分裂和决定细胞命运方面发挥重要作用，同时Wnt/β-catenin 信号通路还能反作用于SOX 基因［11］。

该实验结果显示，SOX2、β-catenin 蛋白均主要表达于细胞核。正常肺组织中无SOX2 蛋白阳性表达，而肺癌组织中SOX2 蛋白阳性表达率达95.4%，提示干细胞因子SOX2 在肺癌的发生中起重要作用。同时，β-catenin 在正常肺组织中有少量(30.0%)阳性表达，在肺癌组织中阳性表达率(75.6%)亦明显高于正常肺组织，提示肺癌组织中Wnt/β-catenin 信号通路处于异常激活状态，其异常表达与肺癌的发生有密切关系。结果还显示，肺癌组织中SOX2 与β-catenin 的表达并未表现出明显的关联。这可能是因为实验仅测定了肺癌组织中SOX2 与β-catenin 蛋白表达的情况，尚未进行mRNA 表达的检测，二者mRNA 表达水平是否有相关性尚需要研究;另外由于影响肺癌发生的基因、蛋白及信号通路十分复杂，Wnt/β-catenin 信号通路是否通过其他基因或通路作用于SOX2 基因，从而参与肺癌的发生发展，将是下一步研究的目标。

综上所述，SOX2 和Wnt/β-catenin 信号通路在肺癌的发生过程中发挥了重要作用，该结果为肺癌的临床治疗提供了新的研究方向。

［1］Jemal A，Siegel R，Xu J，et al.Cancer statistics 2010［J］.CA Cancer J Clin，2010，60(5):277

［2］李进，侯俊，胡敏.干细胞基础研究热点及应用难题［J］.解放军医学杂志，2012，37(6):659

［3］刘培良，王怀林，侯晓军.干细胞治疗基础与临床:国内外最新动态［J］.中国实用内科杂志，2011，31(10):747

［4］Pan J，Zhang Q，Wang Y，et al.26S proteasome activity is down-regulated in lung cancer stem-like cells propagated in vitro［J］.PLoS One，2010，5(10):e13298

［5］杨阳，马翠玲.糖原合成酶激酶3 的分型及其调控肿瘤细胞相关机制的研究进展［J］.解放军医学杂志，2011，36(11):1243

［6］Garcia Campelo MR，Alonso Curbera G，Aparicio Gallego G，et al.Stem cell and lung cancer development:blaming the Wnt，Hh and Notch signalling pathway［J］.Clin Transl Oncol，2011，13(2):77

［7］Sananda Y，Yoshida K，Ohara M，et al.Histopathologic evaluation of stepwise progression of pancreatic carcinoma with immunohistochemical analysis of gastric epithelial transcription factor SOX2:comparison of expression patterns between invasive components and cancerous or nonneoplastic intraductal components［J］.Pancreas，2006，32(2):164

［8］Sholl LM，Long KB，Hornick JL.SOX2 expression in pulmonary non-small cell and neuroendocrine carcinomas［J］.Appl Immunohistochem Mol Morphol，2010，18(1):55

［9］Ying Y，Tao Q.Epigenetic disruption of the WNT/betacatenin signaling pathway in human cancers［J］.Epigenetics，2009，4(5):307

［10］李小江，贾英杰，张文治，等.肺癌干细胞Wnt 信号通路的研究进展［J］.中国肺癌杂志，2011，14(8):695

［11］Kormish JD，Sinner D，Zorn AM.Interactions between SOX factors and Wnt/beta-catenin signaling in development and disease［J］.Dev Dyn，2010，239(1):56