膨化木薯发酵制取燃料乙醇*

张子睿，许淑敏，赵婷，阮燕晔，张良

(沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁沈阳，110866)

燃料乙醇作为一种绿色可再生能源，已成为目前世界上生产规模最大的生物能源，然而燃料乙醇多用玉米等粮食作物为底物发酵制取，影响国家粮食安全［1-2］。我国木薯资源丰富，淀粉含量较高，一般在70%左右，且木薯为非粮作物，生长耐旱、耐瘠，符合“不争粮，不争油，不争糖，充分利用边际性土地”的国家粮食发展战略，是现阶段一种可以大规模工业利用、经济上可行的非粮燃料乙醇生产原料［3-4］。

挤压膨化技术作为一种高温短时处理原料的方法，1960年开始应用于酿造行业［5-8］，现已被应用于黄酒、食醋、白酒、酱油、啤酒、豆酱等进行了大量的研究，有些已实现了工业化生产。膨化能使原料分子间距加大，使不易利用的大分子破碎成小分子，提高糊化率和糖化率，有利于酵母发酵，并能降低能耗，缩短生产周期，减少工业化生产占地面积及提高设备利用率，还能杀死原料中一些有害微生物［9-11］。

木薯发酵生产乙醇的传统生产路线为:木薯干→粉碎→调浆→液化→糖化→发酵→蒸馏→乙醇［12］。本试验将粉碎的木薯干经过膨化处理后直接进行发酵，并使用酒曲替代纯酵母［13］，不仅可省去传统发酵工艺中液化和糖化的过程，节约能源，还可缩短发酵周期，降低成本。

1 材料与方法

1.1 材料

木薯干，市售;酒用酵母酿酒曲，安琪酵母股份有限公司;糖化酶，北京奥博星生物技术有限责任公司，酶活力10万U/g;α-淀粉酶(酶活力3 700 u/g)，北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.2 仪器

HH/6竖线恒温水浴锅，国华电器有限公司;FA2004A电子天平，上海精天电子仪器有限公司;T6新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器责任有限公司;离心机，上海安亭科学仪器厂;DGP50-Ⅱ型膨化机，河北省邢台市裕工科技开发有限公司;WF系列万能粉碎机，江阴市天元药化机械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 试验流程

木薯干→破碎→去杂质→膨化→粉碎→加水调浆→发酵→检测

1.3.2 膨化木薯制备

将木薯干破碎成20目的小颗粒，去杂质后置于膨化机中处理，选取颜色金黄，含水量较少的膨化木薯，用粉碎机粉碎成粉末备用。

1.3.3 单因素试验

取膨化木薯粉100 g于500 mL三角瓶中，分别以时间、加酶量、温度、液固比、接种量、发酵初始pH为自变量，研究不同因素对酒精度和残还原糖量的影响。

单因素试验的试验条件为:温度30℃，酒曲接种量 0.3%，发酵时间 72 h，发酵初始 pH 4.5，液固比3∶1(mL∶g)，糖化酶添加量 150 U/g［14］。

1.3.4 发酵条件的优化

取膨化木薯粉100 g于500 mL三角瓶中，根据Box-behnken中心组合试验设计原理［15-17］，以发酵温度、糖化酶用量、液固比为自变量，发酵后的酒精度、残还原糖量为响应值，设计响应面分析试验，在单因素试验的基础上设定试验的因素和水平值(表1)。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Experimental factors and levels of response surface

1.4 还原糖含量的测定

3，5-二硝基水杨酸(DNS)法［18］。

1.5 酒精度的测定

酒精度的测定采用比重瓶法。通过乙醇水溶液密度与酒精度对照表［19］查得酒精度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 酒曲接种量的确定

图1为糖化酶添加量为0 U/g时，酒曲接种量对酒精度和残还原糖量的影响。由图1可知，当接种量达到 1.5%时，酒精度出现峰值，残还原糖量在1.25%接种量出现波谷。但安琪酿酒曲最适接种量为0.25% ～0.5%，远低于1.5%。这是由于酿酒曲中糖化酶含量过低，无法满足酵母对还原糖的需求，所以额外添加糖化酶，进行分析。

图1 接种量对燃料乙醇发酵的影响Fig.1 Effect of inoculation amount on fuel ethanol fermentation

图2为糖化酶添加量为150 U/g时，酒曲接种量对酒精度和残还原糖量的影响曲线。由图2可知，当接种量在说明书推荐范围0.25% ～0.5%时，酒精度相差很小，接近最高值，残还原糖量也相差很小，接近最低值，当接种量低于0.2%时，酵母量不足，酒精度低于峰值，接种量大于0.5%时，由于酵母量过多，酵母密度太大，影响酵母的正常生长，酒精度下降，残还原糖量骤升。说明接种量0.25% ～0.5%为适宜接种量，选取最高点接种量0.3%。额外加糖化酶能使发酵更加充分，故选用额外添加糖化酶的方法。

图2 接种量对乙醇发酵的影响(加糖化酶)Fig.2 Effect of inoculation amount on ethanol fermentation(add glucoamylase)

2.1.2 糖化酶添加量的确定

由图3可知，当糖化酶添加量达到150 U/g时，酒精度出现波峰，残还原糖量出现波谷。由于存在最适糖化酶浓度，在最适浓度下糖化速率最高，糖化酶浓度偏低或偏高都会导致糖化速率的下降，酵母前期生长增殖时的养分无法得到保障，影响酵母的生长与原料的发酵。经分析150 U/g为最适糖化酶添加量。

图3 酶添加量对乙醇发酵的影响Fig.3 Effect of enzyme concentration on ethanol fermentation

2.1.3 发酵时间的确定

由图4可知，酒精度随时间逐渐增长，达到72 h后，酒精度增长速率明显下降，趋于稳定。而残还原糖量从36 h至72 h逐步下降，72 h至84 h残还原糖量开始回升。因为酒曲中除酵母外，还有各种酶类，额外添加糖化酶，使发酵与糖化同步进行，72 h后乙醇产量与乙醇消耗量接近动态平衡，酒精度趋于稳定，但糖化酶还未失活，72 h后残还原糖量开始升高。所以发酵时间选为72 h。

2.1.4 发酵温度的确定

由图5可知，在30℃酒精度出现波峰，残还原糖出现波谷。30℃前温度过低，不利于菌种的活化与生长，也不利于糖化酶的糖化作用。而温度超过30℃后，由于温度过高，对菌种生长发酵不利，故酒精度下降，但高温更适宜糖化酶的糖化作用，故残还原糖量升高。

图4 发酵时间对乙醇发酵的影响Fig.4 Effect of fermentation time on ethanol fermentation

图5 温度对乙醇发酵的影响Fig.5 Effect of temperature on ethanol fermentation

2.1.5 液固比的确定

图6 液固比对乙醇发酵的影响Fig.6 Effect of liquid-solid ratio on ethanol fermentation

由图6可知，在液固比3∶1(mL∶g)时，酒精度出现波峰，残还原糖量出现波谷，液固比小于3∶1(mL∶g)时，由于溶液浓度过高，渗透压过大，不利于酵母的生长与燃料乙醇的发酵。而液固比大于3∶1(mL∶g)时，溶液浓度过小，酵母生长变慢，同时由于稀释作用使酒精度和残还原糖量变低。

2.1.6 发酵起始pH的确定

由图7可知，发酵起始pH对酒精度和残还原糖量几乎没有影响，由于酒曲内成分复杂，对pH的缓冲能力较强，而糖化酶对pH要求不高，故影响不显著。

图7 发酵起始pH对乙醇发酵的影响Fig.7 Effect of pH on ethanol fermentation

2.2 膨化木薯发酵乙醇最佳工艺参数确定

根据Box-Benhnken模型的中心组合试验设计原理，在单因素试验基础上选取液固比、加酶量和温度3个因素，以酒精度和残还原糖量为考察指标，采用响应面法对膨化木薯发酵乙醇的工艺进行优化，用3因素3水平的响应面分析方法进行试验，试验结果见表2和表3。

表2 响应面设计方案和试验结果Table 2 Response surface design scheme and test results

结果显示:酒精度模型R2=0.988 6说明回归方程的拟合度好，标准误差σ =0.3，经过回归拟合后，温度(A)、加酶量(B)、液固比(C)对酒精度(Y1)的影响可用下面方程表示:Y1=-65.138 4+4.176 771×A+0.122 443 × B+1.491 5 × C-0.000 754 × A × B+0.458 33×A×C-0.000 65×B ×C-0.069 82×A×A-0.000 5×B ×B-0.504 63×C。

残还原糖量只是对乙醇发酵的参考，故不进行优化分析。

表3 酒精度的试验结果方差分析表Table 3 Variance analysis of test results of ethanol

温度(A)，糖化酶(B)，液固比(C)与酒精度之间的关系可通过图8反映出来。

由图8的响应面和等高线图可以看出温度(A)，糖化酶(B)，液固比(C)存在极值点，在此条件下膨化木薯发酵制乙醇的酒精度达到体积分数11.915%，与预测值11.833 8%十分接近，表明预测值和实际值有很好的拟合性，验证了模型的可靠性。由Design-Expert响应面分析软件RSM分析得到膨化木薯发酵制燃料乙醇的最佳发酵条件为:温度31.62℃，糖化酶 144.37 U/g，液固比 2.82∶1。本试验对实际生产控制条件综合对比得到最佳发酵条件为:温度32 ℃，糖化酶145 U/g，液固比 2.8∶1(mL∶g)。

2.3 膨化木薯发酵制燃料乙醇能耗的分析

DGP50—Ⅱ型膨化机每小时可以处理35 kg木薯进行处理，蒸煮液化需2 h。比较膨化技术和传统的液化预处理过程中的能耗，结果如表4所示。相比之下膨化木薯预处理节省了能量约10+0.11-2.057-0.21=7.843 MJ/kg。所以膨化处理降低了能量消耗，提高了生产效率。而使用更大型的膨化机，则可使能耗更进一步降低。

表4 膨化方法和传统方法能耗比较Table 4 Comparison of energy consumption between the expanding method and the traditional method

2.4 膨化木薯发酵制燃料乙醇与传统方法对比

膨化方法与传统方法综合比较结果如表5所示。

表5 膨化方法和传统方法综合比较Table 5 Comparison between the expansion method and the traditional method

膨化木薯发酵条件为:接种量0.3%，发酵时间72 h，发酵前 pH 4.5，温度32 ℃，糖化酶 145 U/g，液固比 2.8∶1(mL∶g)，最终酒精度为 11.94%。

传统木薯发酵条件为:接种量0.3%，发酵时间72 h，发酵前 pH 4.5，温度33 ℃，糖化酶 150 U/g，液固比2∶1(mL∶g)，液化酶用量10 U/g液化时间2 h，液化温度85℃，糖化时间0 h，最终酒精度为12.11%。

膨化处理与传统的处理方法相比，降低了能量消耗，节省了液化的时间，但酒精度下降了1.4%，耗水量也相对上升。

图8 酒精度的响应面和等高线图Fig.8 Ethanol response surface and contour map

3 结论与讨论

本研究采用单因素试验定量比较了接种量，发酵时间，发酵初始pH，温度，糖化酶，液固比对乙醇发酵的影响，同时结合响应面分析法优化膨化木薯发酵制燃料乙醇的工艺，结果表明膨化木薯发酵制燃料乙醇可行，降低了能源消耗，缩短了生产周期，酒精度仅降低了1.4%，但由于膨化使木薯体积增大［22］，耗水量也相对上升。得到的最佳发酵工艺条件为温度32℃，糖化酶145 U/g，液固比 2.8∶1(mL∶g)，接种量0.3%，发酵时间 72 h，发酵前 pH 4.5，发酵酒精度可达到体积分数11.94%，与预测值(11.833 8%)十分接近，说明该模型预测能力较好。挤压膨化处理方法较传统液化蒸煮方法节能75%～85%。

但是，本实验仍有尚待完善之处，如由于发酵与糖化同步进行，发酵终点时糖浓度依然很高，残还原糖的再利用问题，以及发酵终点时酒精度趋于平缓，其发酵动力学曲线尚不明确等问题，都有待继续探索。

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