胃癌BRCA1基因甲基化与BRCA1 mRNA表达的关系研究

孙欣欣，王红兵，徐海洋

(1.徐州医学院研究生学院，江苏 徐州221002;2.徐州医学院附属医院肿瘤内科，江苏 徐州221002)

乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1)是一个抑癌基因，参与基因的转录调节、细胞周期调控、DNA 双链损伤修复、细胞凋亡和泛素化等重要的细胞活动，其中DNA 双链修复途径主要包括:同源重组修复、非同源末端连接［1-3］。胃癌是常见的恶性肿瘤之一，其发生、发展与癌基因的激活、抑癌基因的失活等因素有关，而基因启动子CpG 岛甲基化是抑癌基因失活的一重要途径［4］。抑癌基因启动子CpG 岛异常甲基化常常导致其转录异常、表达下调甚至缺失，进而导致肿瘤的发生［5］。DNA 甲基化在肿瘤基因表达调控、分化发育、细胞增殖等方面起着重要作用，与肿瘤的发生、发展密切相关，因此成为当前分子学研究热点之一。目前国内关于BRCA1 基因甲基化与BRCA1 mRNA 表达相关性在肿瘤中研究甚少，而在胃癌组织中尚无文献报道。本研究采用甲基化特异性PCR 技术检测37 例胃癌组织和对应癌旁组织及6 例正常胃组织中BRCA1 基因启动子CpG 岛甲基化状态;采用逆转录PCR 技术检测37 例胃癌组织和对应癌旁组织及6 例正常胃组织中BRCA1 mRNA 表达水平，探讨BRCA1 基因启动子CpG 岛甲基化与BRCA1 mRNA 表达的相关性及其意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2013年6月至2013年12月徐州医学院附属医院经病理诊断证实的胃癌组织37 例，同时取其对应癌旁组织，另取6 例胃部良性病变旁正常胃组织作为对照组。所有胃癌患者术前均未接受过放化疗，癌旁组织距离癌组织5 cm 以上。37 例患者中，男29 例，女8 例，年龄31 ～80 岁，中位年龄63 岁。所有标本均于术后30 min 内获得，液氮速冻后-80 ℃冰箱保存。

1.2 主要试剂 基因组DNA 提取试剂盒、逆转录PCR 相关试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，EZ DNA methylation-Gold、Hot start Taq DNA 聚合酶购自美国Zymo Research 公司，TRIzol 试剂购自美国ABI 公司，引物由上海生工合成。

1.3 方法

1.3.1 组织DNA 提取和甲基化修饰 每个样本取30 mg 左右组织块进行匀浆处理，参照组织基因组DNA 提取试剂盒说明书提取基因组DNA，UV3000 紫外分光光度仪测定DNA 浓度和纯度，OD260/OD280比值在1.8 ～2.0 之间的DNA 用于甲基化修饰。各样本DNA 取1.5 μg，参照EZ DNA 甲基化试剂盒说明书进行甲基化修饰，修饰好的DNA 洗脱后于-20 ℃保存。

1.3.2 甲基化特异性PCR 法 甲基化引物:M，F:5'-TCGTGGTAACGGAAAAGCGC-3'，R:5'- AAATCTCAACGAACTCACGCCG-3'。非甲基化引物:U，F:5'-TTGGTTTTTGTGGTAATGGAAAAGTGT-3'，R:5'-CAAAAAATCTCAACAAACTCACACCA-3'。PCR 反应体系:PCR 混合液(美国Zymo Research 公 司)12.5 μL，上 下 游 引 物(10 μmol·L-1)各1.0 μL，修饰好的模板2 μL，加无核酶水补足至25 μL。循环条件:95 ℃预变性10 min，然后进行40 个循环扩增:95 ℃变性30 s，甲基化引物及非甲基化引物分别在60 ℃、58 ℃退火55 s，72 ℃延伸30 s，最后于72 ℃延伸7 min。甲基化特异性引物(M)扩增的目的片段为75 bp，非甲基化特异性引物(U)扩增的目的片段为86 bp。取10 μL PCR 产物在3%琼脂糖凝胶上电泳，以TIANGEN 50 bp DNA Lad-der(MD108-01)为标准DNA Marker 同步电泳，EB 染色后凝胶成像系统观察结果并记录。判断标准［6］:M阳性、U 阴性为完全甲基化;M 阳性、U 阳性为部分甲基化;M 阴性、U 阳性为非甲基化。

1.3.3 RNA 提取及逆转录PCR 检测mRNA 每个样本取约100 mg 组织，采用Trizol 试剂(按照说明书操作)提取组织总RNA，紫外分光光度计检测其浓度、纯度，取总RNA 1 μg，按照逆转录说明书合成cDNA。普通PCR 扩增BRCA1 基因，引物如下:F:5'-TTGCGGGAGGAAAATGGGTAGTTA-3'，R:5'-TGTGCCAAGGGTGAATGATGAAAG-3'，扩增的目的片段为292 bp，内参照选用β-actin，F:5'-AAATCTGGCACCACACCTTC-3'，R:5'-CCATCTCTTGCTCGAAGTCC-3'，扩增的目的片段为432 bp。PCR 为25 μL 体系:2 ×Taq PCR Master-Mix(北京天根生化科技有限公司)12.5 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1.0 μL，模板cDNA 2 μL，加水至25 μL，95 ℃预变性2 min，然后进行35 个循环扩增:95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，最后于72 ℃延伸5 min。2%琼脂糖凝胶电泳，电泳结果在紫外灯下观察。根据以下标准判断结果:432 bp 处出现条带，同时292 bp 处出现条带即可判断该标本BRCA1 mRNA 表达阳性;仅432 bp 处出现条带则判断为BRCA1 mRNA 表达阴性。

1.4 统计学处理 采用SPSS 16.0 进行数据分析，BRCA1 基因甲基化、BRCA1 mRNA 表达结果比较采用χ2检验;BRCA1 基因甲基化与BRCA1 mRNA 表达之间的关系分析采用确切概率法及定性资料相关分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 不同胃组织中BRCA1 基因启动子CpG 岛甲基化状态 37 例胃癌组织中有18 例甲基化，其中6 例为完全甲基化，12 例为部分甲基化，总甲基化率为48.6%(18/37);对应37 例癌旁组织中2 例部分甲基化，总甲基化率为5.4%(2/37);6 例正常胃组织中均未检测到BRCA1 基因甲基化，总甲基化率为0. 0%(0/6)。胃癌组织中BRCA1 基因启动子CpG 岛甲基化率显著高于癌旁组织及正常胃组织，差异有统计学意义(χ2=17.541、5.021，P 均＜0.05)。见图1。

2.2 不同胃组织中BRCA1 mRNA 表达 37 例胃癌组织中，阳性表达18 例，阳性表达率为48. 6%(18/37);对应37 例癌旁组织中，阳性表达35 例，阳性表达率为94.6%(35/37)，6 例正常胃组织中均阳性表达，阳性表达率100. 0% (6/6)。胃癌组织中BRCA1 mRNA 阳性表达率显著低于癌旁组织和正常胃组织，差异有统计学意义(χ2=19.215、5.520，P 均＜0.05)。见图2。

图1 不同胃组织中BRCA1 基因启动子CpG 岛甲基化检测结果

图2 不同胃组织中BRCA1 mRNA 表达情况

2.3 BRCA1 基因启动子CpG 岛甲基化与BRCA1 mRNA 表达的关系 18 例BRCA1 基因启动子CpG岛甲基化的胃癌组织中有4 例BRCA1 mRNA 表达阳性，19 例BRCA1 基因启动子CpG 岛非甲基化的胃癌组织中有14 例BRCA1 mRNA 表达阳性，胃癌组织中发生BRCA1 基因启动子CpG 岛甲基化的BRCA1 mRNA 阳性表达率显著低于未发生甲基化的胃癌组织(χ2=9. 799，P ＜0. 05)，BRCA1 基因甲基化与BRCA1 mRNA 表达成负相关(r= -0.515，P ＜0.05)。

3 讨论

BRCA1 基因是与家族性乳腺癌和卵巢癌相关的基因，定位于人染色体17q21，基因组DNA 长约100 kb，具有24 个外显子，其中22 个外显子转录7.6 kb mRNA，最终编码一个由1 863 个氨基酸组成的蛋白质，其相对分子质量为220 000［7］。表观遗传学首先提出基因的DNA 序列没有发生改变，而基因功能发生可遗传的变异，并最终导致表型的改变，主要包括X 染色体失活、DNA 甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA 调控等［8］。DNA 甲基化是表观遗传学研究最深入的内容之一［9］，指生物体在DNA 甲基转移酶的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。甲基化主要发生在启动子CpG 岛5'端胞嘧啶碱基，这些位点在正常情况下处于完全非甲基化状态，CpG 岛发生甲基化往往会导致基因的转录失活或沉默［10］。近年来研究［11］表明，抑癌基因的启动子CpG 岛异常甲基化导致其功能失活是肿瘤发生的重要机制之一。研究［12］也已证实启动子CpG 岛异常甲基化以及肿瘤相关基因的沉默是胃癌发生的重要机制，p16、APC 等基因甲基化在胃癌中已被研究。

本研究采用甲基化特异性PCR 技术检测37 例胃癌组织和对应癌旁组织及6 例正常胃组织中BRCA1基因启动子CpG 岛甲基化状态，结果显示胃癌组织中总甲基化率为48.65%，显著高于癌旁组织的5.4%和正常胃组织的0.0%。本研究结果提示胃癌组织中存在高比例的BRCA1 基因启动子CpG 岛甲基化，说明BRCA1 基因启动子CpG 岛甲基化可能参与了胃癌的发生、发展。本研究在2 例癌旁组织中也检测到BRCA1 基因启动子CpG 岛甲基化，且对应癌组织中均存在该基因完全甲基化，癌旁组织中存在BRCA1 基因启动子CpG 岛甲基化，这一现象可能预示癌旁组织已经处于癌前病变阶段。采用逆转录PCR 检测37 例胃癌组织和对应癌旁组织及6 例正常胃组织中BRCA1 mRNA 表达水平，结果显示，BRCA1 mRNA 的阳性表达率在胃癌组织中为48.6%，明显低于对应癌旁组织的94. 6% 和正常胃组织的100. 0%。为了证实BRCA1 基因启动子CpG 岛甲基化状态与BRCA1 mRNA 表达之间的关系，我们对胃癌组织中甲基化组和非甲基化组BRCA1 mRNA 表达的差异进行分析，结果显示:18 例BRCA1 基因启动子CpG 岛甲基化的胃癌组织中有4 例BRCA1 mRNA 表达阳性，19 例BRCA1基因启动子CpG 岛非甲基化的胃癌组织中有14 例BRCA1 mRNA 表达阳性，而且BRCA1 基因启动子CpG 岛甲基化与BRCA1 mRNA 表达呈显著负相关(r= -0.515，P ＜0.05)，提示BRCA1 基因启动子CpG岛甲基化是导致BRCA1 基因失表达的原因之一。

综上所述，我们初步证实了胃癌组织中存在高比例的BRCA1 基因启动子CpG 岛甲基化，BRCA1 基因启动子CpG 岛甲基化可能是导致BRCA1 mRNA 失表达的主要原因之一，BRCA1 基因启动子CpG 岛甲基化与胃癌的发生、发展有一定关系。由于DNA 甲基化是可逆的基因修饰过程，通过逆转抑癌基因的甲基化状态，恢复细胞正常生长的调节功能，可能成为胃癌治疗的新靶点。

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