肝癌患者氧合血红蛋白紫外-可见吸收光谱的研究

刁振琦，李云涛，熊 洋，饶凤飞，张建民，唐伟跃

(郑州大学物理工程学院，河南 郑州450001)

肝癌是第5 大常见的恶性肿瘤，占肿瘤致死原因的第3 位，其5 a 自然死亡率超过95%［1］。中国占全世界肝癌病例的45%［2］。因此肝癌在世界各地都极受关注。肝癌的创痛治疗方法是手术、化疗。肝癌的早期发现对治疗后的生存率有极大帮助，因此，探索肝癌的早期诊断有重大意义。本文利用健康人、肝癌患者和肝癌术后患者的氧合血红蛋白紫外-可见吸收光谱，研究肝癌的早期诊断。

紫外-可见吸收光谱属于分子光谱，是由于价电子的跃迁而产生的。紫外-可见吸收光谱具有以下3点性质:1)对于同一种物质，浓度越大，吸收强度也越大;2)对于同一物质，同一浓度待测溶液，对不同波长的吸收强度会呈现出不同的状况;3)对于同一物质，最大吸收峰位置与物质的浓度无关，吸收谱的形状完全相同［3］。

紫外-可见吸收光谱的应用非常广泛，常见的应用是对物质进行定量分析，对常量、微量、多组分进行测定;也可根据物质吸收峰的特性来对进行定性分析和结构分析。

血液是有血浆和血细胞组成。血浆为浅黄色半透明液体，其中除含大量水分外，还含有无机盐、白蛋白、球蛋白、酶和各种激素等;血细胞由人体造血器官产生，分为红细胞、白细胞和血小板。红细胞有一定的弹性和可塑性，直径在7 ～8.5 μm 之间，呈双凹圆盘状，中央较薄，边缘较厚。成熟的红细胞无细胞核和细胞器，里面充满了血红蛋白，血红蛋白是含铁的蛋白质，约占红细胞质量的33%，具有运输与结合氧气和二氧化碳的功能。氧合血红蛋白是血红蛋白和氧分子的结合物，是一种亮红色的血红蛋白和氧的化学合成物，把氧气运输到人体组织中。

1 试验仪器与材料

仪器:小型台式离心机TGL216G，紫外-可见吸收光谱仪(UV-101，日本Shimadzu 公司)，电子扫描显微镜(S-505，荷兰Philips 公司);电子透射显微镜(H-606，日本Hitachi 公司)，便携式拉曼光谱仪(R-3000TM，美国Ocean Optics 公司)。

血液样品:30 例健康人、40 例肝癌患者和30 例肝癌术后患者血液样本均采集于郑州大学人民医院和郑州大学肿瘤医院。

化学试剂(质量分数):硝酸银(99.8%)，聚乙烯醇(95%)，浓硫酸(98%)，银棒(99. 9%)，双氧水(30%)，氨水(28%)，去离子水(18.0 MΩ·cm)，载玻片。

2 方法与结果

2.1 提取氧合血红蛋白 取自健康人、肝癌患者和肝癌术后患者的新鲜血液样品每例3 mL，不加任何抗凝剂，在37 ℃室温中放置1 h 左右使其凝结。然后用小型台式离心机5 000 r·min-1离心5 min，使之分层，提取下层红细胞，然后将提取的红细胞按体积比为1∶10 加入到去离子水中，使之溶血。之后再次使用小型台式离心机5 000 r·min-1离心5 min，提取中间溶液即氧合血红蛋白溶液，放置于冰箱中，0 ～4 ℃保存待测。

2.2 健康人、肝癌和术后患者氧合血红蛋白紫外－可见吸收光谱 检测了30 例健康人、40 例肝癌患者及30 例术后患者氧合血红蛋白的紫外-可见吸收光谱。

健康人紫外-可见吸收光谱在413 nm 处出现谱峰，而在肝癌和术后患者紫外-可见吸收光谱中，此谱峰位置分别平移到了410 nm 和412 nm 处。而在541、576 nm 处没有出现谱峰平移的情况。健康人、肝癌术后患者和肝癌患者氧合血红蛋白紫外-可见吸收光谱在413 nm 谱峰附近强度基本呈现出依次增强的情况;而在541、576 nm 处，健康人、肝癌患者和肝癌术后患者氧合血红蛋白紫外-可见吸收光谱谱峰强度基本相同;在413 nm-1附近，肝癌患者紫外-可见吸收光谱的强度普遍要比健康人高很多。见图1。

在正常生理条件下(37 ℃，pH 7.4)，氧合血红蛋白在541 nm 和576 nm 处附近有特征吸收峰，吸收峰的高度不仅与红细胞内氧合血红蛋白溶液浓度的高低有关，而且还与血红蛋白的理化性质(如溶解性稳定性和氧化状态等)有关;吸收峰的位置与不同携氧能力下氧合血红蛋白的构型有关［4-5］，413 nm 附近对应于血红蛋白的特征峰。541 nm 和576 nm 特征吸收峰的峰高、峰位和峰形反映了氧合血红蛋白分子的浓度分子结构的变化及输氧功能的强弱，吸收峰强弱以及峰行的变化反应了氧合血红蛋白分子机构的变化［4］。在413 nm 处附近，健康人、肝癌患者和术后患者呈现出明显不同的光谱强度，肝癌患者紫外-可见吸收光谱的强度普遍要比健康人高很多，肝癌术后患者也比健康人谱峰强度高，可以表明肝癌患者血液中血红蛋白的含量可能高于健康人，肝癌术后患者血红蛋白含量低于肝癌患者，其血液中血红蛋白含量在降低。见图1。

图1 健康人(黑色)、肝癌(红色)和肝癌术后(粉红色)和紫外-可见吸收光谱

3 讨论

实验中检测了健康人、肝癌及术后患者氧合血红蛋白紫外-可见吸收光谱，分析发现肝癌及术后患者氧合血红蛋白紫外-可见吸收光谱在413 nm 谱峰位置出现平移，分别平移到410 nm 和412 nm 处。健康人、肝癌术后患者和肝癌患者氧合血红蛋白紫外-可见吸收光谱在413 nm 谱峰附近强度基本呈现出依次增强的情况;而在541、576 nm 处，健康人、肝癌患者和肝癌术后患者氧合血红蛋白紫外-可见吸收光谱谱峰强度基本相同;在413 nm 处附近，肝癌患者紫外-可见吸收光谱的强度普遍要比健康人高很多，肝癌术后患者也比健康人谱峰强度高，可以表明肝癌患者血液中血红蛋白的含量可能高于健康人，肝癌术后患者血红蛋白含量低于肝癌患者;相对于肝癌患者，肝癌术后患者血液中血红蛋白含量在降低。

［1］徐海峰，杨华瑜，张宏冰，等. 改变肝癌早期诊断和治疗现状的新肝癌血清标志物［J］. 基础医学与临床，2008，28(1):104-108.

［2］李根丛，陆才德.肝癌治疗的现状及发展前景［J］.现代实用医学，2005，17(6):319 -321.

［3］李建军，丁正生，张海燕.常用判别分类方法分析［J］.西安科技大学学报，2007，27(1):138 -142.

［4］Tsujita K，Shiraishi T，Kakinuma K. Microspectrophotometry of nitric oxide-dependent changes in hemoglobin in single red blood cells incubatedwith stimulated macrophages［J］. J Biochem，1997，122(2):264 -270.

［5］魏英耐，陈长青，李云涛，等. 不同剂量电子线照射宫颈癌细胞后红外光谱的统计分析［J］.肿瘤基础与临床，2013，26(3):216-220.