YAP蛋白在甲状腺髓样癌组织中的表达

樊玉霞，刘 洋，刘 征，王晓明，袁青领，卢秀波

(郑州大学第一附属医院甲状腺外科，河南 郑州450052)

甲状腺髓样癌(medullary thyroid carcinoma，MTC)占甲状腺癌的5% ～10%，起源于甲状腺滤泡旁细胞［1］。据报道，MTC 预后较差，超过50%的MTC 患者就诊时已有颈部淋巴结转移，5 a 生存率为25%，10 a生存率为10%，严重威胁着人类的健康和生命。目前MTC 发病机制尚不清楚，探索其发生发展中的关键致病因素，寻找早期诊断的肿瘤标志物及有效的分子治疗靶点对MTC 的早期诊断及治疗至关重要。YAP 蛋白是调控细胞增殖与凋亡的重要蛋白，在多种恶性肿瘤发生发展中具有重要促进作用［2］。本研究应用免疫组织化学技术检测YAP 蛋白在MTC 组织中的表达，初步探讨YAP 蛋白在MTC 组织中的表达情况及意义，为MTC 的诊断和治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 临床资料及主要试剂 50 例甲状腺组织标本均选自郑州大学第一附属医院病理科2012年5月至2014年5月随访资料完整的手术切除标本，其中包括25 例MTC(男9 例，女16 例，年龄17 ～66 岁，中位年龄49 岁)和25 例正常甲状腺组织(男10 例，女15 例，年龄16 ～69 岁，中位年龄48 岁)。所有MTC 患者术前未经过任何抗肿瘤治疗。所有标本均得到2 位以上的病理学专家证实。标本获取后均常规质量分数4%多聚甲醛固定，石蜡包埋制片。实验用兔抗人YAP 蛋白单克隆抗体购于美国Santa Cruz Biotechnology 公司，HRP 标记的抗兔鼠通用型Polymer Kit 和DAB 酶底物显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 免疫组织化学染色 采用免疫组织化学方法检测YAP 蛋白在MTC 和正常甲状腺组织中的表达。切片经过二甲苯常规脱蜡，梯度酒精和蒸馏水水化后，质量分数0.3% H2O2孵育15 min 封闭内源性过氧化物酶，并用EDTA 进行抗原修复。加兔抗人YAP 单克隆抗体(工作浓度1∶100)孵育，4 ℃过夜。PBS 缓冲液清洗3 次，每次5 min。加入HRP 标记的二抗，室温孵育20 min，PBS 缓冲液清洗3 次，每次5 min。DAB 显色2 ～5 min，苏木素轻度复染，冲洗。中性树胶封片。以PBS 缓冲液替代一抗为阴性对照。

1.3 免疫组化的结果判定 阳性细胞数联合染色强度进行评分，采用半定量积分法判断结果。阳性细胞数:≤5%为0 分，＞5% ～25%为1 分，＞25% ～50%为2 分，＞50% ～75%为3 分，＞75%为4 分;阳性细胞染色强度:无色为0 分，浅黄色为1 分，黄色为2 分，深黄或棕褐色为3 分。将2 项积分相乘为最终评分，＜4 分为阴性表达，≥4 分为阳性表达。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0 进行统计分析，率的比较采用χ2检验，检验水准α=0.05。

2 结果

25 例MTC 组织中YAP 蛋白阳性表达率为88.00%(22/25)，阳性信号主要定位于细胞核和细胞浆，染色程度主要为中等或强阳性;而25 例正常甲状腺组织中YAP 蛋白表达均为阴性，2 组YAP 蛋白阳性表达率比较差异有统计学意义(χ2= 39. 286，P ＜0.05)。见图1。

图1 YAP 蛋白在MTC 组织中的表达(200 ×)(A、B、C)

3 讨论

MTC 的发生发展是一个多因素、多步骤、多阶段的复杂过程，与细胞的增殖、凋亡等密切相关。然而目前为止，MTC 发病机制尚不清楚，从分子水平对MTC的发生进展进行研究，对于该恶性肿瘤的诊治及预防具有重要意义。各种肿瘤发生发展的基础是癌基因激活和抑癌基因的突变或失活，YAP 是细胞凋亡信号传导通路上的重要基因，有报道称当YAP 基因突变时，将使细胞异常增生而导致肿瘤发生，因此YAP 被称为是一种候选的癌基因。

YAP 蛋白是Hippo 信号通路中的核心成员，该通路主要调节细胞增殖、凋亡，在胚胎发育及器官形成过程中起着重要作用［3］。Hippo 信号通路激活时，YAP被磷酸化，不能发挥生物学作用，当Hippo 信号通路受到抑制时，YAP 蛋白不被磷酸化，可以进入细胞核内，进而激活下游基因，调控靶基因转录［4］。YAP 在多种恶性肿瘤中呈明显过表达。Tsujiura 等［5］的研究显示YAP 在子宫内膜癌组织中呈过表达，且抑制子宫内膜癌细胞中YAP 的表达可抑制肿瘤细胞生长。Perra等［6］通过构建动物模型发现，在肝癌发生早期即可出现YAP 过表达，并可作为肝癌潜在的治疗靶点。Avruch 等［7］研究发现，YAP 可促进结肠癌细胞增殖及有望成为治疗结肠癌新靶点。此外，Xia 等［8］报道YAP 可以促进卵巢上皮细胞向间质演变，进而促使卵巢癌细胞生长和肿瘤的生成。本研究发现YAP 蛋白在MTC 组织中呈明显过表达，表明YAP 与MTC 蛋白的发生发展密切相关，但其具体的调控机制不清楚，尚有待于进一步研究。

综上所述，YAP 蛋白在MTC 组织中呈过表达，表明YAP 蛋白可能与MTC 的发生发展密切相关，有望成为具有潜在应用价值的分子标记及治疗靶点。但是YAP 蛋白在MTC 发生发展中的具体作用及机制还不明确，深入研究YAP 蛋白信号通路与MTC 的关系将是我们下一步研究的重点。

［1］Maia AL，Siqueira DR，Kulcsar MA，et al.Diagnosis，treatment，and follow-up of medullary thyroid carcinoma:recommendations by the Thyroid Department of the Brazilian Society of Endocrinology and Metabolism［J］. Arq Bras Endocrinol Metabol，2014，58(7):667-700.

［2］Kim SK，Jung WH，Koo JS. Expression of Yes-associated protein(YAP)in breast phyllodes tumor［J］.Int J Clin Exp Pathol，2014，7(9):5997 -6005.

［3］Tariki M，Dhanyamraju PK，Fendrich V，et al. The Yes-associated protein controls the cell density regulation of Hedgehog signaling［J］.Oncogenesis，2014，3:e112.

［4］Gumbiner BM，Kim NG. The Hippo-YAP signaling pathway and contact inhibition of growth［J］.J Cell Sci，2014，127(Pt 4):709 -717.

［5］Tsujiura M，Mazack V，Sudol M，et al. Yes-associated protein(YAP)modulates oncogenic features and radiation sensitivity in endometrial cancer［J］.PLoS One，2014，9(6):e100974.

［6］Perra A，Kowalik MA，Ghiso E，et al.YAP activation is an early event and a potential therapeutic target in liver cancer development［J］.J Hepatol，2014，61(5):1088 -1096.

［7］Avruch J，Zhou D，Bardeesy N. YAP oncogene overexpression supercharges colon cancer proliferation［J］.Cell Cycle，2012，11(6):1090 -1096.

［8］Xia Y，Chang T，Wang Y，et al.YAP promotes ovarian cancer cell tumorigenesis and is indicative of a poor prognosis for ovarian cancer patients［J］.PLoS One，2014，9(3):e91770.