常染色体显性遗传ALPORT综合征一家系COL4A3及COL4A4的基因突变*

束双双，张连云，黄艳梅，张 晶，杨保胜，咸 韦

1)新乡医学院法医物证学教研室 新乡453003 2)新乡医学院第一附属医院肾内科 新乡453003 3)新乡医学院第三附属医院肾内科新乡453003

Alport 综合征(Alport syndrome，AS)又称遗传性肾炎，是一种主要累及肾脏的遗传病。临床上AS主要表现为患者反复血尿、蛋白尿以及进行性肾功能衰退，可伴有眼部疾病和感音神经性耳聋等肾外表现。目前认为AS 的发病机制与编码肾小球基底膜上Ⅳ型胶原α3、α4 和α5 链的基因突变有关，且具有遗传异质性。其中，编码α5 链的COL4A5 基因突变可导致性连锁AS(XLAS，约占85%);编码α3和α4 链的COL4A3 及COL4A4 基因突变可导致常染色体隐性AS(ARAS，约占14%)和常染色体显性AS(ADAS，约占1%)［1-2］。国内关于ADAS 相关基因突变的报道较少。该研究对一ADAS 家系的COL4A3/COL4A4 基因突变进行了分析。

1 对象与方法

1．1 研究对象 先证者(Ⅲ5)，男，21岁，听力下降6 a 余，以“颜面浮肿半个月”为主诉入院，半个月前受凉后出现咳嗽、咳痰。检查示，尿红细胞90～100/HP，异性红细胞比例＞60%，为肾小球源性血尿;24 h 尿蛋白定量5 g。血肌酐146 μmol/L，尿素氮8．64 mmol/L。彩超示双肾弥漫性损伤。电测听检查双耳为中度神经性耳聋。肾活检病理组织学检查示肾小球系膜细胞和基质轻至中度弥漫性增生，肾小管上皮细胞灶状萎缩，肾间质多灶状淋巴细胞和单核细胞浸润伴纤维化。电镜下可见GBM 不规则增厚，节段GBM 变薄，致密层分裂，伴不规则内外侧缘，呈“花篮状”改变，其中可见“电子致密颗粒”。肾活检组织(图1)Ⅳ型胶原抗α3、α4 羟基端非胶原区抗体免疫荧光染色为阴性。该患者AS 诊断明确。

图1 正常人(A)及先证者(B)肾脏基底膜Ⅳ型胶原α 链(免疫荧光，×400)

1．2 家系调查 对该家系成员进行详细调查，调查内容包括年龄、性别、肾功能指标以及听觉和视觉，绘制系谱图(图2)。该家系无近亲结婚史，根据系谱分析符合常染色体显性遗传。在该家系成员中，Ⅱ7、Ⅲ3、Ⅲ5 有不同程度的镜下血尿，均为肾小球源性。Ⅱ7、Ⅲ3、Ⅲ5 出现蛋白尿;Ⅱ7、Ⅲ3 有轻度的神经性耳聋，先证者Ⅲ5 出现了肾功能衰竭，Ⅱ7、Ⅲ3 处于肾功能代偿期(表1)。Ⅰ1 50岁、Ⅱ3 38岁因肾功能衰竭死亡，Ⅱ1 及Ⅱ4 均有长期血尿史。

图2 一ADAs 家系系谱图

表1 一ADAs 家系临床资料

1．3 全基因组DNA 的提取 知情同意后，采集河南汉族一常染色体显性遗传Alport 综合征家系成员12 人外周静脉血，其中男7 人(Ⅱ5、Ⅱ7、Ⅲ1、Ⅲ4、Ⅲ5、Ⅲ6、Ⅳ2)，女5 人(Ⅰ2、Ⅱ2、Ⅲ2、Ⅲ3、Ⅳ1)。另取50 名健康人外周静脉血作为对照。所有血样本采用有机酚-氯仿法提取基因组DNA。

1．4 PCR扩增及测序参照文献［3-4］，根 据COL4A3/COL4A4 基因各外显子临近区域的内含子序列，合成上、下游引物序列。扩增体系25 μL，其中含10 ×Buffer 2．5 μL，2．0 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L 正反引物各1 μL，DNA Taq 酶1 U，100 mg/L DNA 模版3 μL，ddH2O 16．1 μL。反应条件:95℃预变性2 min;94℃变性45 s，退火45 s，72℃延伸45 s，32个循环;72℃再延伸10 min。扩增后经60 g/L 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物，由美国Invitrogen 公司进行双向测序。分析测序结果并与健康人及GenBank 中序列进行比较。

2 结果

对先证者及该家系中患病者COL4A3/COL4A4基因外显子进行测序，并与50 名健康人测序结果及GenBank 序列进行对比分析，共筛选出COL4A3/COL4A4 基因8个突变位点，其中包括1个错义突变、1个内含子突变和6个序列变异。见表2、图3。

图3 COL4A3/COL4A4 基因测序结果

COL4A4 基因第44 外显子的错义突变c．4195 A ＞T 导致M1399L，该家系有症状的患者(Ⅱ7、Ⅲ3、Ⅲ5)均出现了此突变，均表现为杂合子，而作为对照的50 名健康人以及该家系表现正常者中未出现此突变。先证者Ⅲ5 第44 内含子上出现c．4127+11 C ＞T 突变，其他家系成员未见此突变。

3 讨论

ADAS 通常是由COL4A3 和(或)COL4A4 基因突变引起，这些基因定位于2q35～q37，分别编码构成Ⅳ型胶原的α3 及α4 链。COL4A3 及COL4A4 基因突变可导致α3 及α4 链的异常，引起Ⅳ型胶原分子结构的改变和功能的缺陷，进而影响肾脏基底膜的正常网状结构［5］。目前25%～50% AS 的突变为甘氨酸取代突变，甘氨酸被认为是最小的氨基酸，可以插入Ⅳ型胶原紧密的三螺旋内部，它的取代突变可破坏螺旋的形成，进而影响基底膜的结构而导致疾病。ADAS 的常见突变包括甘氨酸取代突变、错义突变、剪接位点突变等，但无明显的突变热点［6］。

该研究发现位于COL4A4 基因第44 外显子上的错义突变c．4195 A ＞T，导致α4 链第1 399个氨基酸由甲硫氨酸替换为亮氨酸(M1399L)，该突变尚未见报道。该家系中凡是有血尿、蛋白尿的患者均出现此突变，表现为杂合子。先证者的母亲(Ⅱ2)无临床表现，基因检测结果未发现异常，50 名健康人也未检测到此突变。推测此突变可能为该家系的致病突变位点，这与文献［7］报道的常见的甘氨酸取代突变有所不同。该突变可能影响了胶原链的组装，但具体机制有待于进一步研究。

该家系中亦发现了一个尚未报道的内含子突变c．4127 +11 C ＞T，该突变仅出现于先证者COL4A4基因上，先证者在该家系存活者中病情最严重，已出现肾功能衰竭。由于该突变未出现在剪接位点，先证者病情严重程度是否与该突变有关尚不清楚。该研究中作者发现COL4A3/COL4A4 基因上有3个同义突变和3个错义突变。文献［8-10］报道以上6个序列变异为多态性位点，这些基因的多态性是否也导致了Ⅳ胶原链形成的异常并引起AS 还有待于进一步研究。

研究［11］表明ADAS 具有遗传多源性。该家系中同样具有杂合突变的Ⅱ7、Ⅲ3、Ⅲ5，其临床表现严重程度不一，蛋白尿、血尿的程度不一，表型和基因型的关系不明确，推测可能与其他染色体上的基因突变有关，需进一步研究。

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