蟾毒噻咛的抗肿瘤作用

王舒雨，赵明蕊，王俊巍，李云飞，岳小欣

1)河南医学高等专科学校药学系 郑州451191 2)郑州大学药学院新药研发中心 郑州450001

蟾皮为蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍等的皮，蟾毒噻咛是其主要化学成分之一。现代医学研究［1］表明，蟾皮中的化学成分具有抗肿瘤、抗乙肝病毒的药理作用。蟾皮临床上主要用于治疗乙型肝炎、慢性支气管炎以及消除痈疮和褪毒止痛，近年来亦用于多种癌症的治疗和辅助治疗，具有缩小瘤块、消除腹水和减缓癌症转移扩散速度的作用。在配合放、化疗的过程中，蟾皮不仅能够提高疗效，还能减轻副作用、改善血常规［2］。作者使用超临界CO2萃取法提取干蟾皮中的蟾毒噻咛，观察蟾毒噻咛对肿瘤细胞株ECa109、HepG2、A549 生长及凋亡的影响，同时观察其对S180 荷瘤鼠腹水瘤的抑制作用，探讨蟾毒噻咛的抗肿瘤作用。

1 材料与方法

1．1 材料 ECa109、HepG2、A549 细胞购自中国科学院上海细胞库。干蟾皮购于河南郑州，由河南中医学院第一附属医院药剂科主管药师赵娅鉴定为中华大蟾蜍的干燥皮。昆明小鼠，雌雄各半，18～22 g，购自河南省实验动物中心。体积分数95%乙醇(分析纯，郑州光明化工有限公司)，RPMI 1640 培养基及胎牛血清(Gibco 公司)，胰蛋白酶(碧云天公司)，DMSO(Sigma Aldrich 公司)，MTT 试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)。CO2细胞培养箱和水平流净化工作台(Thermo Forma 公司)，倒置显微镜(Olympus 公司)，高速低温离心机(Beckman Coulte 公司)，Accuri C6 型流式细胞仪(BD 公司)，Power Wave XS2 酶标仪(BioTek 公司)，LE ICA RM 2235 型石蜡切片机(浙江省金华市益迪医疗设备厂)，DL80-2B 型离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1．2 蟾皮中蟾毒噻咛的提取 以无水乙醇为提取溶剂，采用响应面法研究超临界CO2萃取干蟾皮中蟾毒噻咛的最佳工艺条件为:萃取温度45℃，萃取压力40 MPa，CO2流量10 kg/h。在此条件下蟾毒噻咛收率为2．36%，纯度为98%。

1．3 蟾毒噻咛对3种肿瘤细胞增殖的影响 收集对数生长期的细胞，用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基调整细胞密度为8 ×104mL－1，每孔0．1 mL 接种于96 孔板，置37℃、体积分数5%CO2、饱和湿度的孵箱中培养24 h。每种细胞均分为9组。将蟾毒噻咛溶于DMSO 中，用培养基稀释，使药物终质量浓度为0．125、0．250、0．500、1．000、2.000、4．000、8．000、16．000、32．000 mg/L，对照组加入含体积分数0．1%DMSO 的无血清培养基［3］。继续培养48 h 后，取出细胞培养板，每孔加入MTT溶液20 μL，继续孵育4 h 后每孔加入150 μL DMSO，并于562 nm 波长处测定各孔光密度值(OD值)。细胞抑制率=［(对照组OD 值－实验组OD值)/对照组OD 值］×100%。根据不同质量浓度的药物对细胞生长的抑制率，计算细胞的半数生长抑制浓度(IC50)。

1．4 蟾毒噻咛对HepG2 细胞凋亡的影响 收集4、2、1 mg/L 蟾毒噻咛处理过的HepG2 细胞约(1～5)× 106mL－1，即高、中、低剂量组，500～1 000 r/min 离心5 min，弃去培养液。3 mL PBS 洗涤1次。离心去PBS 后加入冰预冷的体积分数70%的乙醇4℃固定1～2 h。离心弃去固定液，3 mL PBS重悬5 min。400 目筛网过滤，500～1 000 r/min 离心5 min，弃去PBS。加入1 mL 混合后的PI 和Annexin-V FITC 染液，4℃避光染色30 min 后上流式细胞仪检测［4-5］，观察细胞凋亡和细胞周期分布。

1．5 蟾毒噻咛对S180 荷瘤鼠腹水瘤的影响 冻存的S180 瘤株37℃水浴后1 000 r/min 离心5 min，弃上清，将下层细胞用无菌生理盐水调节细胞密度至1 ×107mL－1。取小鼠，腹腔注射S180 细胞悬液0．3 mL。接种第7天，无菌条件下抽取S180 荷瘤小鼠腹腔中乳白色腹水3～5 mL，1 000 r/min 离心5 min，弃上清，下层细胞用无菌PBS(pH 7．4)洗涤3次后，稀释100 倍，加无菌生理盐水调节细胞密度为1 ×107mL－1。在无菌操作下进行传代。传至第4代后抽取腹水，同上处理调整细胞密度为1 ×107mL－1。另取100只小鼠，腹腔注射上述细胞悬液0.3 mL 后按随机数字表分为5组，阴性对照组每日注射0．01 mL/g 生理盐水，阳性对照组注射20 mg/kg 5-FU，蟾毒噻咛高、中、低剂量组分别注射30、20、15 mg/kg 蟾毒噻咛，连续7 d。给药期间，每天观察荷瘤鼠的生存情况，隔天称体重、测腹围。

末次给药后各组处死半数小鼠，在无菌条件下用注射器收集腹腔中全部腹水，测体积，计算腹水抑制率。腹水抑制率=［1 －治疗组腹水量/阴性对照组腹水量］×100%。取新鲜腹水0．4 mL，1 000 r/min 离心5 min，弃去上层组织液，下层细胞用无菌PBS(pH 7．4)洗涤3次，稀释100 倍，加入台盼蓝染液染色3 min(V台盼蓝染液∶V细胞悬液=1∶10)，用细胞计数板在光镜下记录细胞数，计算瘤细胞存活率。瘤细胞存活率=活细胞数/总细胞数×100%。给药结束后，未处死的半数小鼠观察生存时间，计算生命延长率。生命延长率=［(给药组生存时间/阴性对照组生存时间)－1］×100%。

剖取荷瘤鼠肝脏，中性甲醛固定后常规石蜡包埋切片，HE 染色，普通显微镜下观察肝组织的病理变化。

1．6 统计学处理 应用SPSS 16．0 处理数据。采用单因素方差分析比较不同剂量蟾毒噻咛对3种肿瘤细胞的抑制率及各组荷瘤鼠腹水抑制率、瘤细胞存活率和生命延长率，两两比较采用SNK-q 检验，检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 蟾毒噻咛对细胞增殖的影响 随着药物质量浓度的增大，蟾毒噻咛对3种肿瘤细胞的抑制作用增强，其中对HepG2 细胞的抑制作用最强，结果见表1。蟾毒噻咛对ECa109、HepG2、A549 细胞的IC50分别为(7．589 ±1．193)、(2．337 ±0．379)和(6.940 ±0．900)mg/L。

表1 不同剂量蟾毒噻咛对3种肿瘤细胞的抑制率 %

2．2 蟾毒噻咛对细胞凋亡的影响 根据MTT 实验结果，选择细胞抑制作用最显著的HepG2 细胞观察细胞凋亡和周期分布。结果显示蟾毒噻咛高、中、低剂量组凋亡细胞数均多于阴性对照组，且可将细胞周期阻滞在G2期。

2．3 各组荷瘤鼠生命延长率、腹水抑制率、瘤细胞存活率比较 见表2。

表2 各组荷瘤鼠生命延长率、腹水抑制率、瘤细胞存活率比较 %

2．4 肝脏组织学观察 见图1。剖取各组动物肝脏，肉眼可见肝脏颜色偏黄，各叶之间未见粘连，质地较坚韧，表面可见黏性物质，切面未见明显充血、坏死灶等病理改变。镜下见阴性对照组肿瘤组织内癌细胞数量多，排列紧密，异形性明显，核大、深染，核浆比明显异常，细胞出现空泡型变性，多数肝细胞坏死;各治疗组肿瘤细胞浸润程度较轻，异形细胞减少，肝脏细胞接近正常，见图1。

图1 各组荷瘤鼠肝脏的病理形态学表现(HE，×400)

3 讨论

该研究主要观察了蟾毒噻咛的抗肿瘤作用。细胞实验结果表明，蟾毒噻咛对HepG2、A549、ECa109细胞均有较好的抑制作用，其中对肝癌HepG2 细胞的抑制作用最强。利用流式细胞术对细胞的凋亡和周期进行分析，发现蟾毒噻咛能够诱发肝癌HepG2细胞的凋亡，并初步推测其将细胞周期阻滞于G2期。

动物实验［6］表明蟾毒噻咛能明显改善荷瘤鼠的生存状态，延长荷瘤鼠的生存期。该研究结果显示高、中剂量蟾毒噻咛组小鼠腹水抑制率接近或高于5-FU组，蟾毒噻咛各剂量组和5-FU组瘤细胞存活率均低于阴性对照组，且小鼠生存时间延长。病理切片的改变反映了肿瘤细胞在肝脏组织内的转移［7］、扩散和侵袭。该研究结果显示蟾毒噻咛各剂量组和5-FU组的病理切片与正常肝脏接近，其原因可能与腹腔内肿瘤细胞的增殖受到抑制有关。

综上所述，蟾毒噻咛在细胞实验中对HepG2、A549、ECa109 细胞均表现出抑制作用，可能与其促凋亡和周期阻滞作用有关;在动物实验中可抑制S180 腹水瘤细胞生长，从而减少腹水形成，延长荷瘤鼠生存时间，对腹水引起的腹腔转移癌有治疗作用。

［1］曾洋，张爱军，文筱．干蟾皮的研究进展［J］．中国医药科学，2011，1(15):29

［2］王元清，严建业，喻林华．蟾皮的化学成分与临床应用研究进展［J］．时珍国医国药，2009，20(5):1213

［3］罗娟，许伟，薛天阳，等．苦参碱对人神经母细胞瘤SHSY5Y 细胞的作用机制［J］．实用儿科临床杂志，2012，27(3):190

［4］孙凌飞，申文江．蟾皮提取液对肾癌细胞凋亡及Fas、FasL 和bcl-2 表达的影响［J］．中国医药导刊，2000，2(5):32

［5］张巍，赵行宇，李妍，等．不同浓度胡桃醌对Hela 细胞增殖及凋亡的影响［J］．解放军医学杂志，2013，38(2):99

［6］王婷婷，徐国兴．华蟾素的药理作用研究及临床应用进展［J］．国际眼科杂志，2009，9(7):1330

［7］彭方慧，王峰，何炜，等．替吉奥与5-氟尿嘧啶联合纳达铂治疗晚期食管癌的疗效比较［J］．郑州大学学报:医学版，2013，48(2):160