黄芪总苷对二乙基亚硝胺诱导的大鼠肝癌生长的影响

张翔飞

中国人民解放军防空兵学院门诊部 郑州450052

△男，1961年11月生，本科，副主任医师，研究方向:内科

在全世界范围内，肝癌是第6 位最为常见的癌症类型和第3 位最为常见的癌症死因，75%～85%的肝癌为肝细胞癌。炎症和氧化应激在肝细胞癌发生发展过程中起着重要的作用。炎症可改变促肝细胞癌发生的细胞因子的水平，还可增强氧化应激反应，而氧化应激在引发和加速肝细胞癌变过程中起重要作用［1-2］。黄芪总苷(astragalosides，AT)是补益类中药黄芪的主要有效成分之一，具有抗氧化［3］、抗炎［4］等作用。杨雁等［5］的研究显示AT 在体内外对急、慢性肝损伤均有抑制作用，能抑制肝癌细胞株HepG2 和Bel-7404 细胞的增殖。作者采用二乙基亚硝胺(diethyl-nitrosamines，DEN)诱导大鼠肝细胞癌并用AT 处理，观察大鼠肝癌的生长状况，并分析血清IL-6、TNF-α 水平及肝组织中氧化应激相关指标的变化，报道如下。

1 材料与方法

1．1 实验动物、主要试剂及仪器 SD 大鼠，SPF级，雄性，体重180～200 g，由郑州大学实验动物中心提供，合格证号:SCXK(豫)2005-0001。AT 购自安徽百草生物科技有限公司，纯度≥95%，用羧甲基纤维素钠混悬。DEN 购自美国Sigma 公司。谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、丙二醛(malonic dialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide diamutase，SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathinone peroxidease，GSH-Px)活性检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。甲胎蛋白(AFP)检测试剂盒购于上海信然生物技术有限公司。TNF-α 和IL-6 ELISA检测试剂盒购于北京博奥森生物技术有限公司。电子分析天平购于德国赛多利斯公司。酶标仪购于美国Molecular Devices 公司。

1．2 实验分组 将50只SD 大鼠按随机数字表法随机分为正常组、模型组和低、中、高剂量AT组，每组10只。模型组和AT组灌胃给予大鼠2 g/L DEN溶液，剂量10 mg/kg，1次/d，制备大鼠肝癌模型［6］;正常组给予等量生理盐水;共灌胃16 周。从造模第1天开始，低、中、高剂量AT组分别按照10、20、40 mg/kg 的剂量灌胃给予AT，正常组和模型组灌胃给予等量羧甲基纤维素钠。

1．3 观测指标 于末次给药24 h 后，用100 g/L 水合氯醛麻醉大鼠，称体重;断头采血，2 000 r/min 离心15 min，分离血清，－20℃保存，微板法测定血清AST 水平，赖氏法测定血清ALT 水平，胶乳增强免疫比浊法测定血清AFP 水平，ELISA 法测定血清IL-6 和TNF-α 水平。取出肝脏称重，计算肝脏指数，肝脏指数=肝脏质量/体重×100%。记录肝表面结节数。用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)、短径(b)，肿瘤体积=1/2 ×a ×b2。取新鲜肝脏组织，加入生理盐水制成体积分数10%匀浆，－20℃保存;酶联免疫比色法测定肝组织匀浆中MDA 含量和SOD、GSH-Px 活性。

1．4 统计学处理 采用SPSS 13．0 进行统计学处理，5组间各指标的比较采用单因素方差分析和LSD-t 检验，检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 5组大鼠肝脏指数、肿瘤体积及肝表面结节数的比较 见表1。与正常组比较，模型组大鼠肝脏指数明显增加。与模型组比较，AT组肝脏指数、肝表面结节数、肿瘤体积均减小。

表1 5组大鼠肝脏指数、肿瘤体积及肝表面结节数的比较

2．2 5组大鼠血清AST、ALT 和AFP 水平的比较见表2。与正常组比较，模型组大鼠血清AST、ALT和AFP 水平明显升高。与模型组比较，AT组大鼠血清AST、ALT 和AFP 水平降低。

表2 5组大鼠血清AST、ALT 和AFP 水平的比较

2．3 5组大鼠血清IL-6 和TNF-α 水平的比较 见表3。与正常组比较，模型组大鼠血清IL-6 和TNFα 水平明显升高。与模型组比较，AT组血清IL-6 和TNF-α 水平降低。

表3 5组大鼠血清IL-6 和TNF-α 水平的比较

2．4 5组大鼠肝组织中MDA 含量、SOD 和GSHPx 活性的比较 见表4。与正常组比较，模型组大鼠肝组织中MDA 含量明显升高，SOD 和GSH-Px 活性明显降低。与模型组比较，AT组肝组织中MDA含量降低，SOD、GSH-Px 活性增强。

表4 5组大鼠肝组织中MDA 含量、SOD 和GSH-Px 活性的比较

3 讨论

DEN 是一种具有致癌性的化学毒物，其诱癌动态过程类似于人类肝癌发生过程，历经肝损伤、肝纤维化、肝硬化最终发展成为肝癌［7］。该研究结果显示，模型组大鼠肝脏指数较正常组明显增加，血清AST、ALT 和AFP 水平明显升高，表明造模成功。与模型组比较，AT组大鼠肝脏指数、肿瘤体积及肝表面结节数，血清AST、ALT 和AFP 水平明显降低。血清AST、ALT 水平的降低间接表明受损肝细胞数量减少;AFP 水平的降低间接表明肝癌细胞形成数量减少或低分化程度得到一定的阻抑。上述结果表明AT 对DEN 诱发的肝癌具有生长抑制作用。

炎症与肿瘤细胞形成、进展、增生、浸润、血管生成、转移等多个肿瘤发展环节相关。肝癌是与炎症联系最为密切的肿瘤之一，往往是在肝炎的基础上发展起来。IL-6 和TNF-α 是促进肝癌发生发展的两种重要炎症介质。Pikarsky 等［8］指出TNF-α 可激活肝细胞内的NF-κB，既能促进细胞变异，导致癌细胞“疯狂”生长，还能协助变异细胞由原发肿瘤部位转移到身体其他部位。邬善敏等［9］通过实验证实沉默IL-6 基因能够抑制肝癌细胞迁移，肝癌细胞IL-6 表达增高能促进其自身的迁移。该实验结果显示，与正常组比较，模型组大鼠血清IL-6 和TNF-α水平升高，而AT组大鼠血清IL-6 和TNF-α 水平较模型组显著降低，提示AT 可能通过抗炎作用阻止肝癌的发生发展。

低水平的活性氧在细胞的生理过程中必不可少，然而，活性氧水平增加可引起氧化应激反应并使细胞处于潜在的毒性环境中，导致生物大分子氧化损伤、中性粒细胞炎性浸润、组织受损。氧化应激在肝细胞癌的发生与进展中起着关键作用。MDA 是脂质过氧化标志物，与肝细胞癌危险因素病毒感染及炎症具有很好的相关性［1］;SOD 能够催化超氧阴离子自由基通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢;GSH-Px 能够将毒性过氧化物还原成无毒化合物，同时促进过氧化氢分解，避免细胞膜结构与功能遭受过氧化物的损害及干扰。在该研究中，模型组大鼠肝组织中MDA 含量明显升高，SOD、GSH-Px 活性明显降低，与何伟等［7］的报道相一致。AT组上述指标较模型组明显改善，说明AT 能够明显抑制DEN 所引起的大鼠体内的氧化应激反应。

总而言之，此次研究初步阐明AT 可抑制DEN诱导的大鼠肝细胞癌的生长，作用机制可能与其抗炎和抗氧化作用有关。

［1］Marra M，Sordelli IM，Lombardi A，et al．Molecular targets and oxidative stress biomarkers in hepatocellular carcinoma:an overview［J］．J Transl Med，2011，9:171

［2］Li Y，Chang SC，Goldstein BY，et al．Green tea consumption，inflammation and the risk of primary hepatocellular carcinoma in a Chinese population［J］．Cancer Epidemiol，2011，35(4):362

［3］王世博，邱景富，白群华，等．黄芪甲苷对H2O2致PC12细胞氧化应激损伤的保护作用［J］．中国药理学通报，2011，27(11):1603

［4］Gui DK，Huang JH，Guo YP，et al．Astragaloside Ⅳameliorates renal injury in streptozotocin-induced diabetic rats through inhibiting NF-kappa B-mediated inflammatory genes expression［J］．Cytokine，2013，61(3):970

［5］杨雁，陈敏珠．黄芪总苷对肝癌细胞凋亡及wtp53 基因表达的影响［J］．中国药理学通报，2001，17(4):447

［6］芮文娟，何淑芳，黄先甲，等．DEN 诱导大鼠肝纤维化-肝癌过程中pSmad3L 和PAI-1 蛋白的表达［J］．中国药理学通报，2012，28(10):1393

［7］何伟，宋莎莎，袁平凡，等．雷公藤红素对二乙基亚硝胺诱导的大鼠肝纤维化的治疗作用及机制［J］．中国药理学通报，2013，29(4):519

［8］Pikarsky E，Porat RM，Stein I，et al．NF-kappa B functions as a tumour promoter in inflammation-associated cancer［J］．Nature，2004，431(7007):461

［9］邬善敏，卢超，袁方均．IL-6 对肝癌细胞HepG2 浸润迁移能力的影响［J］．胃肠病学和肝病学杂志，2012，21(7):594