依那普利预处理对大鼠心肌组织解偶联蛋白2和诱导型一氧化氮合酶表达的影响

康丹丹，汤建民

郑州大学第二附属医院心血管内科 郑州450014

解偶联蛋白2(uncoupling protein-2，UCP2)是位于线粒体内膜上的载体蛋白，介导氧化磷酸化与ATP 合成解偶联，抑制活性氧的生成［1］，保护细胞免受氧化应激，对抗心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)是NO 合成的限速酶，内皮型NOS(epidermal nitric oxide synthase，eNOS)和诱导型NOS(induced nitric oxide synthase，iNOS)是与MIRI 有关的主要NOS 亚型。随着研究的不断深入，近年来提出了药物预适应(pharmacological ischemic preconditioning，PIP)这一概念。国内外研究［2-4］证实，药物预处理对MIRI 具有保护作用。目前关于UCP2 的研究大多基于缺血缺氧刺激，有关PIP 与UCP2 的研究则较少，而有关iNOS 与PIP 的研究则罕见报道。该实验通过建立大鼠缺血再灌注损伤模型，检测心肌组织UCP2 及iNOS 的表达，进一步探讨依那普利预处理对心肌的保护机制，为药物治疗提供线索及依据。

1 材料与方法

1．1 实验动物与分组 健康成年SD 雄性大鼠35只，购于河南省实验动物中心，体重250～300 g，适应性喂养5 d。将大鼠采用随机数字表法分为假手术组(Sham组)7只、缺血再灌注组(IR组)14只、依那普利预处理组(PIP组)14只。PIP组给予依那普利10 mg/(kg·d)灌胃，余给予生理盐水2 mL/d 灌胃。预处理1 周后制作大鼠MIRI 模型，获得Sham组6只、IR组8只、PIP组9只。

1．2 试剂 依那普利片(10 mg)由扬子江有限公司提供，RT 试剂盒、PCR 试剂盒、Marker 由Transgene 公司提供，ECL 试剂盒由北京中杉金桥生物技术有限公司提供，小鼠抗大鼠UCP2 抗体、羊抗大鼠iNOS 抗体、GAPDH 抗体由Santa Cruz 公司提供，二抗由Zymed 公司提供。

1．3 仪器 小型动物呼吸机(型号:Inspira)由北京创博环球生物科技有限公司提供，小动物心电图机(型号:SBP-2000)由上海茂生生物科技发展有限公司提供，D-140 图像记录分析系统由大连竞迈仪器有限公司提供，PCR 扩增仪、EP 管由Eppendorf 公司提供。

1．4 模型建立及心肌标本采集 用体积分数10%水合氯醛按3 mL/kg 腹腔注射，麻醉成功后，固定大鼠，连接心电图机于四肢皮下。气管切开插管，呼吸机辅助呼吸，潮气量20 mL/kg，频率60～70次/min。开胸暴露心脏，剪开心包，挤出心脏，于左心耳根部冠状动脉起始处用5 号丝线穿过该动脉。Sham组只穿线不结扎，余2组将一带有凹槽的细乳胶管垫于血管与结扎线之间，结扎30 min，剪开结扎线，取出细乳胶管，关胸后再灌注120 min。模型成功标准:结扎线远端的缺血心肌变白，颜色变暗，心电图上QRS 波增宽增高［5］或伴ST 段抬高，证实左前降支结扎成功。再灌注后缺血部位心肌颜色恢复，QRS 波振幅减低，抬高的ST 段回落，证实结扎血管再灌注成功。实验结束后摘取心脏，获取左室缺血区心肌组织，分为2 份，用预冷的PBS 盐水洗净残血，1 份在液氮中迅速冷冻，2 份均存放于－80℃冰箱保存备用。

1．5 血清磷酸激酶(CK)活性和丙二醛(MDA)含量测定 实验结束后采取2 mL 心室血，4 000 r/min离心10 min 后取血清，全自动生化分析仪测定血清CK 活性及MDA 含量。

1．6 心肌组织UCP2 和iNOS mRNA 检测 UCP2上游引物5'-TCCTGGCAGGTAGCACCA-3'，下游引物5'-CCCGAAGGCAGAAGTGAAG-3'，扩增产物大小为311 bp。iNOS 上游引物5'-GCTGTCTGACCCTCA TTTT-3'，下游引物5'-GCTGTCTGACCCTCATTTT-3'，扩增产物大小为180 bp。GAPDH 上游引物5'-CCACGGCAAGTTCAACGGCACA-3'，下游引物5'-GCGGCATGTCAGATCCACAACG-3'，扩增产物大小为589 bp。取心肌组织100 mg，用Trizol 法提取组织总RNA，逆转录合成cDNA，以2 μL cDNA 为模板进行扩增。扩增条件:94℃预变性2 min;94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35个循环;72℃总延伸6 min。取5 μL 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，EB 染色。目的基因的相对表达量以目的基因和GAPDH 条带的灰度值之比来表示。

1．7 心肌组织UCP2 和iNOS 蛋白检测 按每20 mg 心肌组织加100～200 μL 的比例加入蛋白裂解液，4 000 r/min 离心5 min，取上清液获得组织蛋白。蛋白经电泳分离后转移到硝酸纤维素膜上，用质量分数0．1%的丽春红染色，剪下带有Marker 条带的膜和滤纸，在转移缓冲液中平衡30 min。除去气泡后合上夹子，倒入转移槽中，100 V 电压转移80 min，质量分数5%脱脂奶粉TBST 封闭2 h。将一抗按1 ∶1 000 稀释加入膜上，4℃摇床过夜孵育，TBST 冲洗3次，分别为15、10、5 min。将膜与二抗按1∶4 000 稀释，37℃恒温床孵育45 min，TBST 冲洗3次，每次5 min。用ECL 显色，将胶片扫描后用Bandscan 5．0 进行灰度分析。

1．8 统计学处理 采用SPSS 17．0 分析数据。各组CK 活性、MDA 含量、UCP2 和iNOS mRNA 与蛋白表达的比较均采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验。检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 血清CK 活性和MDA 含量 与Sham组相比，IR组及PIP组血清CK 和MDA 含量升高，而PIP组较IR组降低(表1)。

表1 各组大鼠血清CK 活性、MDA 含量比较

2．2 心肌组织UCP2 表达 与Sham组相比，IR组及PIP组心肌组织UCP2 蛋白、mRNA 表达升高;PIP组较IR组降低。见图1、2 和表2。

图1 各组大鼠心肌组织UCP2 及iNOS 蛋白的表达

图2 各组大鼠心肌组织UCP2 mRNA 的表达

2．3 心肌组织iNOS 表达 与Sham组相比，IR组及PIP组心肌组织iNOS 蛋白、mRNA 表达升高;PIP组较IR组进一步升高。见图1、3 和表2。

表2 各组大鼠心肌组织UCP2、iNOS 蛋白及mRNA 表达的比较

图3 各组大鼠心肌组织iNOS mRNA 的表达

3 讨论

氧自由基爆发［6］是引起MIRI 的重要作用机制之一，氧化应激产生的活性氧可以上调及激活UCP2的表达。Krauss 等［7］把超氧化物加入分离的线粒体中，发现其激活UCP2 介导的质子漏。UCP2 通过解偶联作用抑制活性氧的生成，被誉为体内抗氧化因子。该实验观察到IR组代表氧化应激引起细胞损伤［8］的指标MDA 含量升高，同时UCP2 表达也升高;与IR组相比，PIP组血清MDA 含量、CK 活性降低，UCP2 表达降低，说明氧化应激减弱，心肌细胞损伤减少，证明依那普利具有对抗MIRI 的作用。依那普利预处理的确切作用机制尚不清楚，可能与其抑制AngⅡ诱发的活性氧生成有关［9］。依那普利抑制UCP2 表达上调，是通过减少缺血区诱导的氧化应激起作用。

MIRI 引起内皮细胞功能紊乱，舒血管物质与缩血管物质比例失调。内源性NO 是一类舒血管活性物质，其合成受iNOS 的调节。生理条件下iNOS 无活性，正常组织也较少表达。在缺血缺氧、炎症刺激等病理条件下则开始表达［10］，催化生成NO 参与MIRI的调节，NO 发挥心肌毒性或心肌保护的作用主要取决于NO 的释放量。研究［11］表明缓激肽可激活NOS促进NO 合成，并通过NO-cGMP 途径或其他途径实现心肌保护作用，更有学者［12］认为某些心血管疾病的发生与缓激肽受体调节有关。该实验结果显示，IR组iNOS 表达升高，证明缺血缺氧刺激可诱导其表达。给予依那普利预处理后其活性进一步升高，同时反映心肌损伤的指标CK 活性降低，说明依那普利通过增强iNOS 活性减轻MIRI。这一作用机制可能与其抑制AngⅡ生成，减少缓激肽降解，保留其更多生物活性，促进iNOS 产生更多NO 有关。

总之，依那普利预处理可能通过下调UCP2、上调iNOS 的表达而实现其心肌保护作用。由于该研究未进行与药物作用机制、目的蛋白有关因子的研究，致使对其作用机制的推测有一定的局限性。

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