RNA干扰沉默survivin基因对结直肠癌裸鼠移植瘤的影响

李日恒 张 娇 李山峰 温聪娜 刘 博 康 然 耿 艳 马 芳 彭新宇 刘 茜 滑志娟 张爱民

(河北大学附属医院普外科，河北 保定 071000)

survivin基因在结直肠癌发生发展过程中发挥重要作用，沉默survivin在体外结直肠癌试验中发挥显著的生长抑制作用。之前的研究显示，survivin-siRNA重组腺病毒载体pBAsisurvivin在 SW480细胞中有显著的抑制作用，最适浓度为100 nmol/L，但pBAsi-survivin在体内的效果还不清楚。本研究希望通过构建结直肠癌裸鼠移植瘤模型，检测pBAsi-survivin在体内对结直肠癌的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料 构建成功的survivin-siRNA重组腺病毒pBAsi-survivin，腺病毒载体系包含 pBAsi-Hh1、pBAsi-HU6、pBAsi-Mu6，Trizol试剂、第一链cDNA合成试剂盒;survivin引物和内参GAPDH引物及siRNA模板均购自大连宝生物工程有限公司。BALB/C裸鼠(编号:72915235216)购自南京君科生物科技有限公司，雄性，15只，6周龄，体重16～18 g，SPF级动物，空气相对湿度40% ～60%，温度20℃ ～24℃，光照时间12 h/12 h。

SW480细胞购自中国医学科学院肿瘤细胞库。培养条件:RPMI1640+10%FBS 培养基 37℃，5%CO2，pH 7.2 ～ 7.4，无菌恒温培养。

电子天平，游标卡尺。低温高速离心机(湖南湘立科技仪器有限公司)，核酸电泳仪、电泳槽、电转仪(北京六一仪器厂);紫外分光光度仪(上海精密仪器有限公司)，PCR仪(Thermo北京科誉兴业科技发展有限公司)。凝胶成像系统(Biorad GelDoc XR上海旦鼎国际贸易有限公司)，水平摇床(上海乔跃电子有限公司)。PVDF膜，封闭液，洗脱液、脱脂奶粉，一抗、酶标二抗，蛋白提取液及相关抗体购自碧云天生物研究所。酶标仪(BIO-RAD上海普林斯顿生物科技发展有限公司);DMSO MTT液96孔板(北京世纪奥利生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 裸鼠模型建立及体内实验方案 正常培养的SW480细胞用胰酶消化，离心，弃上清，沉淀用RPMI1640培养基重悬，滴度调整到细胞悬液1×107/ml，注射到各BALB/C裸鼠右侧腋窝皮下，待肿瘤生长至100 mm3。将裸鼠随机分为survivin siRNA腺病毒载体组(A组，5只)、空载体对照组(B组，5只)、空白对照组(C组，5只)，饲养在SPF级屏障系统IVC环境内，称重标号后分别给每组鼠瘤内注射(100 nmol/L)pBAsi-survivin、空白载体、生理盐水 50 μl 1 次，分别在第 1、4、7、10、13、16、19天给药，1次/d，每天观察裸鼠的精神、饮食等一般情况，并观察移植瘤的大体形态，给药后第2天测肿瘤的大小并记录，于接种后第3周末处死，完整剥取瘤块并称重，计算抑瘤率，抑瘤率=(1-实验组平均瘤重/空白对照组平均瘤重)×100%;肿瘤体积测定(V)=1/2〔肿瘤长径(L)×肿瘤短径(S)2〕。

1.2.2 RT-PCR检测survivin mRNA的变化 取瘤组织约35～50 mg，剪碎、液氮下研磨，按RNA提取试剂盒步骤提取肿瘤组织的总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳，110 V，30 min。Gelred染色液染色，在紫外分光光度仪下进行分析。引物序列:survivin正义:5＇-CAGATTTGAATCGCGGGACCC-3＇，反 义 5＇-CCAGAGTCTGGCTC GTTCTCAG-3＇，产物长度206 bp;内参 GAPDH 正义:5＇-GGAAGGTGAAGGTCGGAGT-3＇，引物序列:5＇-GACCACCTGGTGCTCAGTGT-3＇，产物长度 295 bp，PCR 扩增条件:94℃ 30 s，60℃ 30 s，74℃1 min共30个循环，产物由PCR仪进行定量分析〔1〕。

1.2.3 Western印迹检测survivin蛋白的表达情况 提取总蛋白，制备浓缩胶和分离胶，将蛋白经电泳分离，电转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭1.5 h，分别与1∶100稀释的一抗4℃孵育过夜，TTBS洗膜，1∶200 稀释的二抗孵育 1.5 h，TTBS洗膜，以β-actin为内参，化学发光 ，洗片，观察survivin蛋白表达强度的变化〔2〕。

1.3 统计学处理 采用SPSS16.0软件，实验数据均以s表示，组间比较采用t检验，多组之间比较用单因素方差分析。

2 结果

2.1 裸鼠皮下移植瘤不同时间点的体积变化及肿瘤抑制率A、B、C三组肿瘤体积在第1、4天变化无统计学意义(P＞0.05);在第7、10、13、16、19 天，A 组的肿瘤体积与 B、C 组的体积有统计学差异(P＜0.05)，B组和C组体积变化无统计学意义(P＞0.05)。见表1。随着时间的延长，与B、C组比较，A组体积增长逐渐减慢，A、B、C组移植瘤重分别为(0.534 2±0.022 3)、(1.296 9±0.031 7)、(1.289 2±0.033 4)g;相对于 C组，A组抑瘤率为58.56%，B组抑瘤率为0.59%。

2.2 RT-PCR检测survivin mRNA水平的变化 A、B、C组survivin mRNA 相对含量分别为 0.446±0.008、0.714±0.006、0.712±0.002，A组survivin mRNA的相对表达抑制率为39.4%，明显高于B组 8.9%和C组8.7%，差异有统计学意义(P＜0.05)。B组和C组survivin mRNA表达无统计学意义(P＞0.05)。

表1 各组裸鼠肿瘤体积随时间的变化(V/mm3，s，n=5)

表1 各组裸鼠肿瘤体积随时间的变化(V/mm3，s，n=5)

与A 组比较:1)P＜0.05

组别 1 d 4 d 7 d 10 d 13 d 16 d 19 d A 组 100.32 ±17.54 132.79±19.28 161.35±32.85 189.13±32.54 229.15±43.89 275.53±46.73 317.49±47.81 B 组 98.73±17.14 146.55±36.75 205.13±31.191) 285.97±34.651) 379.11±62.131) 465.25±76.451) 569.39±83.421)C 组 101.35±18.06 153.86±31.32 209.88±22.161) 291.64±38.431) 392.46±62.361) 473.39±77.951) 574.47±84.361)

2.3 Western印迹检测survivin蛋白的表达 A、B、C组survivin蛋白相对含量分别为 0.401 ±0.008、0.730±0.008、0.734±0.002;A组survivin蛋白的相对表达抑制率为47.3%，明显高于B组10.1%和C组9.7%，差异有统计学意义(P＜0.05)。B组和C组survivin mRNA表达无统计学意义(P＞0.05)。

3 讨论

肿瘤的发生是凋亡与增殖失衡的结果，survivin是目前发现的分子量最小、作用最强的凋亡抑制因子。研究表明survivin在人的胚胎、胸腺、甲状腺、生殖腺、神经细胞、结肠上皮细胞等正常组织少量存在，而在结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、淋巴瘤、皮肤癌、前列腺癌等多种肿瘤组织中高度表达〔3〕。survivin在结直肠癌中的总阳性表达率为53.2%〔4〕，survivin高度表达的肿瘤患者生存期明显缩短〔3，5～7〕。survivin抑制细胞凋亡的途径主要有两条，一种是直接作用于 Caspase，主要通过结合Caspase-3和Caspase-7抑制二者的活性;survivin也可通过P21间接抑制Caspase活性。另一种是survivin与细胞周期调控因子CDK4竞争性结合，导致CDK2/cyclin-E激活和核糖体(Rb)磷酸化，Rb磷酸化后启动细胞进入周期，加快G1/S期的转换，使P21从survivin-CDK4复合物中释放出来，促使CDK4活化，与线粒体pro-caspase-3结合，抑制caspase-3活性，阻止线粒体释放 Cyt-c，抑制细胞凋亡〔8〕。

RNA干扰技术(RNAi)是通过双链RNA(dsRNA)在细胞内诱导与之同源的特异性mRNA表达受抑制，从而引起基因转录后水平沉默。研究表明沉默survivin对多种肿瘤的凋亡有明显的促进作用〔9〕。Yan等〔10〕构建的腺病毒载体的siRNA用于转染肝癌细胞HepG2后，surivivin mRNA和蛋白的表达明显降低，细胞凋亡增加。Wen等〔11〕用RNAi技术将用沙门菌质粒将survivin基因沉默的同时，将GRIM-19表达，并转染入喉癌裸鼠移植瘤中，能明显抑制喉癌细胞的增殖，抑制率为53.4%。

结直肠癌目前治疗采用以手术切除为主、放化疗为辅的综合治疗，但中晚期结直肠癌治疗效果不理想，亟需寻找其他的治疗办法。沉默survivin不仅能抑制结直肠癌细胞的增殖，还能增加化疗药物的敏感性。鉴于survivin基因在结直肠癌细胞中高表达的特性，通过RNAi技术，可以抑制特定序列基因survivin的表达，从而促进肿瘤细胞的凋亡，达到治疗肿瘤的目的。

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9 Markus P，Ghadim I，Eric D，et al.Survivin is a viable target for the treatment of malignant peripheral nerve sheath tumors〔J〕.Clin Cancer Res，2012;18:2545-57.

10 Yan G，Duan RH，Yin K，et al.Inhibition of survivin expression to induce the apoptosis of hepatocarcinoma cells by adenovirus-mediated siRNA〔J〕.Biosci Trends，2008;2(2):88-93.

11 Wen LJ，Gao LF，Jin CS，et al.Small interfering RNA survivin and GRIM-19 co-expression salmonella plasmid inhibited the growth of laryngeal cancer cells in vitro and in vivo〔J〕.Int J Clin Exp Pathol，2013;6(10):2071-81.