血管内皮生长因子-C表达与非小细胞肺癌淋巴管生成和淋巴结转移的相关性

张增雷 宋秋颖 胡 静 张 伟 潘艳明 任凤云

(牡丹江医学院附属红旗医院，黑龙江 牡丹江 157011)

在众多影响肺癌患者预后的指标中，淋巴结转移程度决定了患者预后和治疗手段的选择。近来，由于淋巴管的特异性标志物如 LYVE-1，prox-1，podoplanin和D2-40等的发现，使研究肿瘤新生淋巴管的临床和病理学意义成为可能，也使研究肿瘤淋巴管生成和淋巴结转移逐渐成为研究热点。本实验通过检测非小细胞肺癌(NSCLC)组织血管内皮生长因子(VEGF)-C的表达情况及微淋巴管密度(LMVD)，拟揭示VEGF-C的表达及LMVD与包括淋巴结转移在内的病理学参数间的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料 来自2007年9月至2008年6月哈尔滨医科大学附属第二医院和附属第三医院确诊为NSCLC患者的手术切除组织，其中腺癌58例，鳞状细胞癌38例。样本取自手术切除的肺叶组织，标本经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，常规HE染色，其中60例新鲜组织置于液氮中速冻，储存于－80℃低温冰箱中直至RNA抽提。兔抗人VEGF-D多克隆抗体和鼠抗人D2-40单克隆抗体购自Santa Cruz公司。PV-9000免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。实时定量RT-PCR(QRT-PCR)检测试剂均购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 免疫组织化学染色和结果判定 参照PV9000两步法免疫组织化学试剂盒，DAB显色，苏木素复染，中性树脂封片，光镜观察。PBS代替一抗作阴性对照。以细胞质和细胞膜呈现棕黄色颗粒为阳性，以每张切片中看到＞30%的肿瘤细胞质染色阳性判定为VEGF-C阳性。在低倍镜下，选取D2-40阳性脉管最丰富的区域，在200倍视野范围计算5个视野的淋巴管数目，取其平均值作为LMVD。

1.3 QRT-PCR

1.3.1 总RNA的提取及反转录反应 将肺癌组织从液氮中取出，研磨成粉末，转入DEPC水处理过的1.5 ml EP管中，按比例加入总RNA提取液RNAiso reagent(TaKaRa Code.D312，大连)，按操作说明书提取肺癌组织总RNA，－70℃保存待用。取适量稀释后测定A260和A280的吸光度比值，计算RNA浓度。另取5 μl RNA溶液用1.2%琼脂糖凝胶电泳，观察RNA的完整性。取总 RNA 1 μg，以 Oligo dT和 Random 6 mers(TaKaRa，大连)为引物，使用 Prime ScriptTM RT-PCR Kit(TaKaRa Code.DRR014A，大连)进行反转录反应，按照操作说明进行反转录反应，反应产物－20℃保存待用。

1.3.2 引物设计与合成 在GenBank上查找人VEGF-C基因的mRNA序列，取其保守区，使用Primer Premier 5.0设计引物，以GAPDH为内参，引物由TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司合成。VEGF-C基因的引物序列:正义5'-CCGTGAAAATGCTGAAAGAGG-3'，反义5'-GTTGCCGATGTGAATGAGGA-3';GAPDH基因的引物序列:正义5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，反义 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。随机取两样本的cDNA作为模板，应用Thermal Cycler DiceTM Real time system(TaKaRa，大连)进行Real Time PCR扩增，分析扩增曲线和融解曲线，鉴定引物的特异性。

1.3.3 VEGF-C mRNA的荧光定量PCR检测 RT反应体系:5×Prime ScriptTM 缓冲液 2 μl，Prime ScriptTM RT Enzyme Mix I 0.5 μl，Oligo dT Primer(50 μmol/L)0.5 μl ，Random 6 mers(100 μmol/L)0.5 μl，总 RNA 2 μl，RNase Free dH2O 4.5 μl，反应条件为:37℃ 15 min 85℃ 5 s，PCR反应体系为:SYBR Premix Ex Taq(2×)12.5 μl，上下游引物(各 10 μmol/L)0.5 μl、RT 产物 2 μl、dH2O 10 μl至 25 μl。反应条件为:95℃ 预变性10 s;95℃ 5 s，60℃ 30 s，45个循环。以目的基因 VEGF-C与内参照(GAPDH)的比值表示目的基因的相对含量。每个样本重复3次，以均值表示结果。

2 结果

2.1 VEGF-C免疫组化染色结果 在免疫组化染色中，VEGFC的染色具有不均匀性，癌侵犯边缘区域染色与癌中心区域差异明显，尤其以中晚期的肿瘤表现更为明显。VEGF-C染色的阳性部位位于肿瘤细胞的胞质内，呈棕黄色颗粒。癌中央区，VEGF-C阳性反应可见于肿瘤细胞和间质内的巨噬细胞，癌侵犯边缘区VEGF-C阳性反应亦可见于Ⅱ型肺泡上皮细胞细胞和巨噬细胞，见图1。癌侵犯边缘部位VEGF-C的阳性表达率〔57例(59.41%)〕明显高于癌中央部位的阳性表达率〔42例(43.8%)〕(P=0.030)。

图1 NSCLC组织VEGF-C表达(×200)

2.2 VEGF-C蛋白表达与临床病理资料的相关性 在癌侵犯边缘区，VEGF-C高表达组淋巴结转移的发生明显高于低表达组(P=0.014)，在癌中央区却未发现这种相关性。见表1。

表1 NSCLC组织VEGF-C表达与临床病理学参数的相关性〔n(%)〕

2.3 VEGF-C mRNA在NSCLC组织的表达 癌中央组织VEGF-C基因的表达量(0.352±0.263)明显低于癌边缘组织(0.957±0.451)和癌周围肺组织(0.856±0.339)(P＜0.001)，但VEGF-C mRNA的表达量在癌边缘组织与癌周肺组织之间无统计学差异(P=0.170)。对于边缘部位，VEGF-C的高表达与淋巴结转移具有相关性(P=0.023)。见表2。

表2 NSCLC组织VEGF-C mRNA表达与临床病理参数的相关性(s)

表2 NSCLC组织VEGF-C mRNA表达与临床病理参数的相关性(s)

病理因素 n 癌边缘 P值 癌中央 P值类型 腺癌 39 1.033±0.445 0.076 0.397±0.281 0.067鳞癌 21 0.816±0.437 0.267±0.206分化 高分化 17 0.882±0.400 0.422 0.324±0.219 0.605中、低分化 43 0.987±0.470 0.363±0.280 TNM分期ⅠA/ⅠB 30 0.922±0.475 0.787 0.326±0.247 0.707ⅡA/ⅡB 12 0.956±0.460 0.398±0.369ⅢA 18 1.016±0.420 0.364±0.213淋巴管侵犯 阴性 34 0.931±0.468 0.610 0.334±0.243 0.549阳性 26 0.991±0.434 0.375±0.291淋巴结转移 阴性 36 0.850±0.412 0.023 0.336±0.236 0.575阳性 24 1.118±0.467 0.375±0.303

2.4 VEGF-C与LMVD的相关性 D2-40特异染色管腔不规则的淋巴管(图2A)。D2-40阳性淋巴管在肿瘤组织分布不均匀，癌中央淋巴管大多管腔较小，由于肿瘤细胞的浸润，多数管腔不完整而充填入肿瘤组织或管腔处于塌陷状态(图2B)。癌侵犯边缘淋巴管大多管腔处于扩张状态，且腔内可见浸润转移的肿瘤细胞(图2C)。

肿瘤组织中，癌边缘部位 LMVD明显高于癌中央区(19.01±7.55 vs 15.15±5.72，P＜0.001)。有淋巴管侵犯的肿瘤组癌边缘LMVD明显高于无淋巴组(21.37±7.93 vs 17.48±6.27，P=0.009)。有淋巴结转移的肿瘤组癌边缘LMVD明显高于无淋巴结转移组(21.28±7.89 vs 17.81±6.90，P=0.024)。

LMVD高于平均密度的肿瘤组定义为高淋巴管密度组，反之定义为低淋巴管密度组。在癌侵犯边缘区，高淋巴管密度组VEGF-C表达明显高于低淋巴管密度组(P＜0.005，图3A);而在癌中央区，这种相关性虽未达到统计学意义，但高淋巴管密度组较低淋巴管密度组仍有相对较高的VEGF-C mRNA表达(P=0.102，图3B)。

图2 D2-40特异染色检测LMVD(×200)

图3 癌侵犯边缘淋巴管密度及癌中央LMVD与VEGF-C mRNA表达的关系

3 讨论

大部分恶性肿瘤(尤其是上皮来源的恶性肿瘤)早期以淋巴道转移为主，因此，区域引流淋巴结的转移情况是评估预后和制定治疗策略的重要生物学指标。近年来，由于淋巴管特异性标记物及淋巴管生成因子的发现，使越来越多的人开始进行恶性肿瘤的淋巴道转移研究。

NSCLC在肿瘤早期即可发生淋巴结转移。以往关于NSCLC淋巴管生成的研究多见于VEGF-C和其受体VEGFR-3的研究。然而，对于VEGF-C影响NSCLC预后这一问题上结论不一致〔1～4〕。本研究显示，VEGF-C的表达在癌侵犯边缘高于癌中央区。在癌中央区，VEGF-C的表达与淋巴结转移之间未见相关性，然而在癌组织的侵犯边缘，VEGF-C的表达与肿瘤的淋巴管侵犯或淋巴结转移呈正相关。在癌组织侵犯的边缘区，VEGF-C高表达的肿瘤组其淋巴结转移的发生率明显高于低表达组的发生率，而且淋巴管侵犯的发生率亦明显增高。

对于NSCLC而言，Kajita等〔2〕应用免疫组织化学染色方法报道VEGF-C表达与肿瘤淋巴结转移的发生明显相关，Arinaga等〔3〕报道没有明显的相关性。本研究结果提示，应用免疫组化和PCR研究，研究结果是否一致很可能取决于所检测的部位。虽然QRT-PCR检测显示的VEGF-C mRNA表达不仅仅来源于肿瘤细胞，还有间质细胞等阳性部位，但是癌侵犯边缘VEGF-C的同时高表达且与淋巴结转移和淋巴管侵犯的相关性提示我们，VEGF-C的高表达有利于肿瘤淋巴管生成和肿瘤细胞的淋巴管转移，提示对VEGF家族整体的研究也许比在实验条件下单独研究其中某一因子更为重要，这也许正是多年来这方面动物实验研究与临床实验研究始终存在分歧的原因所在。

D2-40为淋巴管内皮细胞的特异性标志物，其免疫组化染色可以检测淋巴管和肿瘤细胞的淋巴管侵犯〔5，6〕。而且，肿瘤侵犯边缘的高淋巴管密度有可能决定了肿瘤细胞的淋巴转移〔7〕。本实验显示，大部分D2-40阳性管腔位于肿瘤的边缘，而且癌周淋巴管密度明显高于癌内淋巴管密度，与癌周低淋巴管密度组相比，癌周的高淋巴管密度组VEGF-C mRNA表达也明显高于癌周低淋巴管密度组，而且癌周的高淋巴管密度组的淋巴结转移和淋巴管侵犯的发生率亦明显增高。

综上，NSCLC组织VEGF-C的表达可能调控着肿瘤的淋巴管生成，癌侵犯边缘VEGF-C的高表达可能与淋巴管的生成和肿瘤细胞发生淋巴管侵犯和淋巴结转移密切相关。本研究也说明，VEGF-C在NSCLC组织组织不同部位的表达有明显的差异，对癌组织的不同部位进行有选择的VEGF-C表达检测，会更加有利于评估患者的淋巴管生成和淋巴结转移的发生情况。

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2 Kajita T，Ohta Y，Kimura K，et al.The expression of vascular endothelial growth factor C and its receptors in non-small cell lung cancer〔J〕.Br J Cancer，2001;85(2):255-60.

3 Arinaga M，Noguchi T，Takeno S，et al.Clinical significance of vascular endothelial growth factor C and vascular endothelial growth factor receptor 3 in patients with nonsmall cell lung carcinoma〔J〕.Cancer，2003;97(2):457-64.

4 Kurahara H，Takao S，Maemura K，et al.Impact of vascular endothelial growth factor-C and-D expression in human pancreatic cancer:its relationship to lymph node metastasis〔J〕.Clin Cancer Res，2004;10(24):8413-20.

5 Ogawa E，Takenaka K，Yanagihara K，et al.Clinical significance of VEGF-C status in tumour cells and stromal macrophages in non-small cell lung cancer patients〔J〕.Br J Cancer，2004;91(3):498-503.

6 Niakosari F，Kahn HJ，Marks A，et al.Detection of lymphatic invasion in primary melanoma with monoclonal antibody D2-40:a new selective immunohistochemical marker of lymphatic endothelium〔J〕.Arch Dermatol，2005;141(4):440-4.

7 Padera TP，Kadambi A，di Tomaso E，et al.Lymphatic metastasis in the absence of functional intratumor lymphatics〔J〕.Science，2002;296(5574):1883-6.