水通道蛋白1和4在大鼠挫伤肺组织中的表达

孙相华 洪文娟 洪志鹏 周 菊 祝艳翠

(昆明医科大学第一附属医院干部医疗科，云南 昆明 650032)

肺挫伤是创伤病人中常出现的一种闭合性损伤，创伤导致的肺组织出血、水肿是急性呼吸窘迫综合征的主要危险因素，老年患者由于身体各项功能都出现衰退趋势，加上基础疾病较多，因此病情更加复杂、凶险，显著加大了救治难度〔1〕，早期采取有效措施减轻肺水肿对于改善患者预后具有重要意义〔2，3〕，研究肺挫伤水肿的机制，对于肺挫伤患者的临床治疗具有重要的指导意义。本研究检测水通道蛋白(AQP)1和4在挫伤肺组织中的表达变化，探讨肺水肿的形成机制。

1 材料和方法

1.1 肺挫伤模型制作及分组 健康老年雄性SD大鼠100只，体重450～500 g，由昆明医科大学实验动物中心提供。肺挫伤模型采用金属球自由落体打击法制作，老年大鼠麻醉后放置于水平实验台上，180 g重物自1 m高处自由落体，垂直撞击于大鼠右侧胸廓，于设定时间点麻醉后断头处死，分为四组:假手术组，模型1、3和6 h组，每组25只，其中10只做水含量测定，10只做分子生物学检测，5只做组织病理检测。

1.2 肺组织含水量的测定 大鼠麻醉后取肺组织，称量右肺中叶肺组织湿重，后置于100℃恒温鼓风干燥箱中干燥2 d后称重，计为干重。根据下列公式计算肺组织水含量:(湿重-干重)/湿重×100%。

1.3 肺组织HE染色 取大鼠右肺上叶组织，4%多聚甲醛固定后，切片，常规脱水、脱蜡，行HE染色。

1.4 RT-PCR 根据标准的RNA提取步骤提取总RNA，使用反转录试剂盒(Promega)进行反转录，具体操作根据说明书进行。利用琼脂糖凝胶电泳检测各组AQP1和4的表达，以β-actin作为内参照，Image J软件定量分析各电泳条带的灰度值，RT-PCR产物以各样本目的基因与β-actin的灰度值进行比较，AQP1 上游引物序列:5＇-AAAGTGGCAAGGAAGGGACA-3＇;下游引物序列:5＇-GCTGTGGATGTTGGGAAAGAG-3＇。AQP4 的上游引物序列:5＇-TTGGACCAATCATAGGCGC3＇;下游引物序列:5＇-GGTCAATGTCGATCACATGC-3＇;β-actin 上游引物序列:5＇-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3＇;下 游 引 物 序 列:5＇-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3＇。

1.5 Western印迹分析 老年大鼠100 mg肺组织加入裂解液匀浆，冰上碾磨匀浆后，12 000 r/min离心10 min取上清，BCA法蛋白定量，取蛋白样品50 μg，电泳后转膜，5%的脱脂奶粉封闭1 h，β-actin、AQP4和1抗体(均购自美国Santa cruz公司)稀释液孵育(1∶200)，4℃过夜，TBST洗膜，5%的牛奶稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗羊二抗，洗膜后，按照ECL说明书，1∶1配置发光工作液，凝胶成像仪成像。

1.6 统计学分析 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析及LSD-t检验。

2 结果

2.1 肺组织湿/干重比和病理改变 模型1、3、6 h组湿/干比重(0.932 4±0.079 6、1.537 8±0.071 3、2.378 0±0.071 3)显著高于假手术组(0.799 1±0.069 3)(P＜0.05)。模型 3、6 h 组与模型1 h组有显著差异(P＜0.05)、挫伤后1 h组织肺泡腔内未出现明显水肿液，3 h后，光镜下见挫伤肺组织间质出现明显肿胀，肺泡壁毛细血管出现明显扩张、红细胞外漏、水肿明显，肺泡腔内出现少量水肿液;挫伤后6 h，黏稠液体充满肺泡腔，肺泡间隔出现明显水肿，有大量炎性细胞浸润，假手术组未出现明显异常。

2.2 各组肺组织AQP1和4的mRNA和蛋白表达量 与假手术组相比，模型3、6 h组肺组织内AQP1和4 mRNA和蛋白表达明显升高(P＜0.05)。与模型1 h组比较，模型6 h组有显著差异(P＜0.05)。见图1 和图2，表1。

图1 各组肺组织中AQP1和4 mRNA的RT-PCR电泳

图2 各组肺组织中AQP1和4蛋白的Western印迹检测

表1 各组中AQP1和4灰度分析(s，n=10)

表1 各组中AQP1和4灰度分析(s，n=10)

与假手术组相比:1)P＜0.05;与1 h 组相比:2)P＜0.05

假手术组 0.19±0.02 0.08±0.01 0.02±0.01 0.17±0.03模型 1 h 组 0.21±0.05 0.10±0.02 0.19±0.04 0.21±0.06 3 h 组 0.98±0.151)0.78±0.111)0.49±0.061)0.78±0.121)6 h 组 1.02±0.211)2)0.82±0.191)2)1.23±0.211)2)0.85±0.191)2)

3 讨论

研究表明弥漫性肺泡损害、低氧血症、挫伤区肺组织的血水肿、通气与换气功能障碍时肺挫伤的主要病理生理机制〔4〕，其中肺水肿是导致肺通气功能障碍的主要原因，引起肺组织水肿的原因主要有两方面:一方面，创伤直接破坏血管内皮和肺泡上皮的屏障完整性，使通透性增加〔5〕;另一方面，肺挫伤后继发性产生的炎性介质，活性氧残基导致肺泡水的清除能力明显降低〔4〕。水代谢异常显著降低了肺组织的顺应性和氧合功能，是影响患者预后的重要因素。

研究证实AQP在肺挫伤后组织水肿形成中发挥重要作用，其中，AQP1在肺挫伤后组织中的表达量明显升高〔6〕，Verkman等〔7〕在敲除AQP1基因的研究发现，AQP1参与渗透压驱动的肺内水运动，能够促进肺水肿的形成;袁军等〔6〕在大鼠肺挫伤模型中研究发现AQP1的表达在肺挫伤后明显升高，可能是肺水肿的重要参与者。AQP4蛋白最初在1994年从大鼠的肺组织中克隆出来的一种选择性水转运体，属于汞不敏感性AQP家族〔8〕，采用电镜和免疫细胞化学技术检测发现AQP4定位于肺组织的气管、支气管上皮及成纤维细胞的膜基质侧顶部，此外AQP4也存在于气管、支气管的柱状上皮的基质侧，AQP4在肺泡水的转运及气道表面液体的调整中发挥重要作用。Verkman等〔7〕证实发现AQP1缺失可导致肺泡毛细血管间的水通透性下降10倍，AQP1和4均敲除小鼠水通透性降低14～16倍。研究采用血管外肺水(EVLW)技术发现，AQP4的主要作用是保持肺泡相对干燥，在正常状态下表达较少，血管外肺水量的增加可以显著诱导AQP4蛋白表达，以纠正“渗出-吸收”的失衡〔7，9〕。朱丽华等〔10〕在大鼠油酸性急性肺损伤模型中发现，AQP4在油酸导致损伤的肺组织中表达明显升高，这与本实验的研究结果具有一致性，同时还证明早期使用肾上腺能β2受体激动剂特布他林可以上调肺泡Ⅱ型细胞AQP4表达，明显减少肺泡腔渗出，减轻肺损伤，显著减少细胞外肺水的含量，提示AQP4在肺泡水肿中可以加强水转运发挥重要的抗水肿作用;推测肺挫伤后AQP4表达升高，是一种肺挫伤后的代偿性升高，可能利于减轻肺泡腔水肿。以往研究证实AQP1在肺挫伤后表达也明显升高，本研究结果与前期研究具有一致性〔11，12〕，AQP1 蛋白的表达增加则可以加重肺水肿，因此调节二者比值的平衡可能对于肺水肿早期的治疗具有重要意义，未来还需要进一步使用敲除AQP4或1基因及两者同时敲除的基因验证二者在肺挫伤中肺水肿的作用。

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6 袁 军，陈 阳，程利宝.大鼠挫伤肺组织中水通道蛋白1表达变化〔J〕.法医学杂志，2009;25(2):85-7.

7 Verkman AS.Role of aquaporins in lung liquid physiology〔J〕.Respir Physiol Neurobiol，2007;159(3):324-30.

8 Badaut J，Fukuda AM，Jullienne A，et al.Aquaporin and brain diseases〔J〕.Biochim Biophys Acta，2013;205(7):154-60.

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10 朱丽华，李涛平，何 琳.大鼠油酸性急性肺损伤初期水通道蛋白4在肺水代谢的实验研究〔J〕.南方医科大学学报，2008;28(5):707-11.

11 王腾腾，王道喜.水通道蛋白1在大鼠挫伤肺损伤中的表达变化〔J〕.中国医学工程，2012;20(3):160-1.

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