p-STAT3与缺氧诱导因子在结肠癌组织中的表达及其临床意义

张晓芹 史迎莉 贾小云 李 涛 王 军 张 红 (陕西中医学院基础医学院，陕西 咸阳 7046)

信号转导和转录激活子(STAT)是信号传导与转录激活因子家族成员之一，在多种细胞生长、分化、凋亡及其功能发挥过程中起着重要的作用〔1〕。STATs是1992年在研究干扰素诱导基因转录时鉴定出的一个胞质蛋白家族，目前已发现哺乳动物STAT家族有7个成员，而STAT3磷酸化水平反映STAT通路的活化状态〔2〕。STAT3正常呈无活性状态，在Janus激酶的作用下发生磷酸化成为磷酸化的STAT(p-STAT3)，p-STAT3分子形成二聚体，继而进入细胞核与特异的DNA序列结合，调节下游相关靶基因的转录和表达〔3〕。STAT3活化可以诱导多种与细胞增殖、分化、凋亡等生物学行为密切相关的下游靶基因的表达〔4〕。缺氧诱导因子(HIF-1α)存在于哺乳动物及人体内，可调节多种靶基因的表达，与多种肿瘤细胞的凋亡和增殖有关〔5〕。Jung等〔6〕发现 ST AT3 可以抑制 HIF-1α 的降解，增加HIF-1α的合成，与HIF-1α共同调节肿瘤细胞生长因子的转录，提示ST AT3是调控HIF-1α表达的重要转录因子。目前研究发现，STAT3的持续活化与白血病、胃癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞的异常增殖密切相关〔7〕，但STAT3调控结肠癌的机制尚不清楚，本实验探讨p-STAT3在结肠癌发病中的作用和机制及其对临床的指导意义。

1 材料与方法

1.1 一般资料 材料取自陕西中医学院第一附属医院2009年4月至2011年3月手术切除并经病理确诊为结肠癌和相应的癌旁组织标本40例(癌旁组织经病理学证实不含癌细胞)，其中男29例，女11例，年龄44～74岁，全部病例术前均未接受过放疗和化疗，组织学分型均为腺癌。

1.2 主要试剂 兔抗人P-STAT3和HIF-1α多克隆抗体购自Santa Cruz公司(SC-21876;SC-10790)，SABC试剂盒及DAB显色剂购自博士德公司。

1.3 试验方法 所有标本均经10%甲醛固定，石蜡包埋，4 μm连续切片。采用免疫化学SABC法，主要步骤如下:切片常规脱蜡至水，电炉热抗原修复10 min;冷却后采用3%H2O2室温下孵育15 min;加5%的牛血清室温下孵育30 min封闭非特异性结合;滴加一抗 P-STAT(浓度1∶300)、HIF-1 α(浓度1∶200)4℃孵育过夜;滴加二抗(生物素化羊抗兔IgG浓度1∶500)，37℃孵育2 h;滴加 SABC，37 ℃孵育30 min，PBS 液清洗3次，每次5 min;DAB显色，镜下控制反应时间，显色适度后蒸馏水冲洗终止显色;苏木精轻度复染细胞核，自来水冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。

1.4 结果判定 采用PBS代替一抗做阴性对照，p-STAT3以细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性;HIF-1 α以细胞质或细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性;每张切片随机选取10个高倍视野(×400倍)，每个视野中100个细胞被计数，计算平均阳性率，阳性细胞数≥10%为(+)。

1.5 统计学方法 应用SPSS10.0软件进行 χ2检验和Spearman等级相关分析。

2 结果

2.1 p-STAT3和HIF-1α蛋白表达定位 p-STAT3和HIF-1α主要表达在细胞核，HIF蛋白阳性信号表达在细胞质。

2.2 p-STAT3蛋白在不同结肠组织中的表达 在40例结肠癌组织中有37例表达阳性，阳性表达率为92.5%，明显高于癌旁组织(2.5%，P＜0.01)，见图1。

图1 p-STAT3蛋白在不同结肠组织中的表达(DAB，×200)

2.3 HIF-1α在人不同结肠组织中的表达 在40例结肠癌组织中有37例表达阳性，阳性表达率为87.5%，明显高于癌旁组织(5%，P＜0.01)，见图2。

2.4 结肠癌组织中p-STAT3和HIF-1α表达的关系 结肠癌组织中p-STAT3和 HIF-1α的阳性表达强度呈正相关(r=0.313，P＜0.05)。

图2 HIF-1α蛋白在不同结肠组织中的表达(DAB，×200)

3 讨论

研究提示STAT3的持续激活可导致细胞异常增殖和恶性转化〔7〕，本实验提示STAT3的激活与结肠癌细胞增殖密切相关。pSTAT3检测可作为结肠癌诊断的重要标志物。

HIF-1 α存在于哺乳动物及人体内，研究发现HIF-1 α高表达的恶性肿瘤大多分化差，进展快、血管生成密度高、易发生转移及复发、预后差〔8〕。目前确定多种因子受到HIF-1 α的调控，包括VEGF及血管内皮生长因子受体(VEGFR)、腺苷酸激酶3、促红细胞生成素(EPO)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)等，涉及参与肿瘤细胞的能量代谢、增殖、凋亡、转移、耐药及血管新生等多个方面。HIF-1 α的活性对维持肿瘤细胞能量代谢、促进肿瘤血管生成、促进肿瘤细胞侵袭和转移起重要作用，并与肿瘤细胞的凋亡和增殖有关〔9〕。

本研究结果显示:p-STAT3和HIF-1α在结肠癌组织中高表达，明显高于癌旁组织，且二者呈正相关。研究结果表明，p-STAT3和HIF-1 α的过度表达在结肠癌的诊断中具有重要价值，有望成为判断结肠癌恶性程度的新指标。STAT3可通过促癌基因或抑癌基因的异常表达促进肿瘤细胞的分裂繁殖，HIF可通过VEGF促进肿瘤血管形成，为肿瘤细胞不断生长提供物质供应，p-STAT3和HIF-1 α在结肠癌组织中所呈现的正相关提示:p-STAT3可能通过促进HIF的转录共同促进结肠癌的发生和发展。而STAT3和HIF在肿瘤发展中的直接关系，尚有待进一步研究。

1 张 伟，吴 强，谭德明.STAT3小干扰RNA的构建及其对胃癌细胞增殖和凋亡的影响〔J〕.第二军医大学学报，2007;29(7):603-5.

2 Atreya R，Mudter J，Finotto S，et al.Blockade of interleukin 6 trans signaling suppresses T-cell resistance against apoptosis in chronic intestinal inflammation:evidence in crohn disease and experimental colitis in vivo〔J〕.Nat Med，2000;6(5):583-8.

3 Demoulin JB，van Roost E，Steven M，et al.Distinct roles for STAT1、STAT3 and ST-AT5 in differentiation gene induction and apoptosis inhibition by interleukin-9〔J〕.Biol Chem，1999;274(36):25855-61.

4 Ma XT，Wang S，Ye YJ，et al.Constitutive activation of Stat3 signaling pathway in human colorectal carcinoma〔J〕.World J Gastroenterol，2004;10(11):1569-73.

5 Nishi H，Nakada T，Kyo S，et al.Hypoxia inducible factor 1 mediate up regulation of telomerase(h TERT)〔J〕.Mol Cell Biol，2004;24(13):6076-83.

6 Jung JE，Lee HG，Choi H，et al.STAT3 is a potential modulator of HIF-l mediated VEGF expression in hum an renal carcinoma cells〔J〕.FASEB J，2005;19(10):1296-8.

7 Niu G，Wright KL，Huang M，et al.Constitutive STAT3 activity up-regulates VEGF expression and tumor angiogenesis〔J〕.Oncogene，2002;21(13):2000-8.

8 张剑虹，张 飞，张 凡，等.老年乳腺癌MGMT、GST-P、H IF-1α表达与临床预后关系的组织芯片研究〔J〕.中国老年学杂志，2009;29(7):1600-2.

9 樊利芳，刁路明.低氧诱导因子-1α在结直肠腺癌中的表达及意义〔J〕.中华病理学杂志，2004;6(33):242-6.