c-Myb截短突变体的构建及其对c-Myc蛋白表达的调节

秦玺 ，程龙，饶春明，高凯，杨琦，史新昌，徐小洁，叶棋浓，王军志

1.中国食品药品检定研究院 生物制品检定所，北京1 000502；2.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100850

转录因子c-Myb 由原癌基因c-Myb编码，分别由DNA结合区（DNA binding domain，DBD）、转录激活区（central transactivation domain，TAD）、负调节区（negative regulatory domain，NRD）和亮氨酸拉链构成，是一个进化上高度保守的蛋白[1]，与白血病、结直肠癌、乳腺癌、黑色素瘤等恶性肿瘤的发生发展相关[2-4]。c-Myb 促进细胞的增殖，主要通过调控其靶基因的转录来实现自身功能。c-Myc是c-Myb 的靶基因，c-Myb 能够结合到c-Myc基因启动子的2个区域，调节c-Myc基因的转录和表达[5-8]。c-Myc 在20%的肿瘤患者中处于活化状态，c-Myc 表达的增强，会促进细胞恶变，最后导致肿瘤的发生[9-10]。临床标本中c-Myb 的表达与c-Myc 的表达呈正相关性，但c-Myb 各结构域对c-Myc 的调节及作用机制还不清楚。为了进一步明确c-Myb 各结构域对c-Myc 的调节，我们构建了c-Myb 不同结构域的截短突变体，分别命名为c-Myb-1、c-Myb-2、c-Myb-3、c-Myb-4、c-Myb-5和c-Myb-6，并在乳腺癌细胞中检测了这些突变体对c-Myc 表达水平的调节，为进一步研究c-Myb各结构域的功能及其在肿瘤中的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

人胚肾细胞293T、乳腺癌细胞MCF-7、真核表达载体pcDNA3.0-FLAG、c-Myb野生型质粒pcDNA3.0-FLAG-Myb、c-Myc由本室保存；大肠杆菌感受态细胞DH5α、细胞裂解液购自天根生化科技有限公司；DMEM 培养基和胎牛血清购自GIBCO公司；限制性内切酶KpnⅠ、XhoⅠ，DNA 连接酶，高保真Taq酶试剂盒购自NEB 公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、PCR 回收试剂盒购自Promega 公司；c-Myc 抗 体、HRP-FLAG 抗体和GAPDH 抗体购自Sigma 公 司；SDS-PAGE 胶 和PVDF 转膜系统购自Invitrogen 公司；PCR 引物（表1）合成和DNA 测序由北京奥科鼎盛生物公司完成。

1.2 c-Myb截短突变体的构建

以野生型c-Myb为模板，分别进行重组PCR 扩增，胶回收PCR 产物；用KpnⅠ和XhoⅠ分别酶切PCR 产物和空载体pcDNA3.0-FLAG，胶回收酶切产物，16℃连接4 h，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂布含氨苄西林的LB 平板，37℃过夜生长；挑取平板上的克隆做菌落PCR鉴定，阳性克隆提质粒后用KpnⅠ和XhoⅠ酶切鉴定。

1.3 Western印迹

转染48 h 后收集细胞，加入细胞裂解液及SDS-PAGE 加样缓冲液，煮沸15 min，12 000 r/min离心2 min，上清液进行SDS-PAGE，电泳后将蛋白转至PVDF 膜，用5%脱脂奶粉封闭1 h，用一抗孵育1 h，TBST洗膜3次，每次7 min，二抗孵育1 h，TBST洗膜3 次，每次7 min，将含辣根过氧化物酶的ECL底物滴于膜上反应5 min，吸干后用X线胶片显影。

表1 PCR引物及序列

2 结果

2.1 c-Myb 截短突变体表达载体的构建及酶切鉴定

野生型c-Myb结构域如图1所示[14]。其中，DBD分为R1、R2和R3 区，均起到与DNA 结合的作用。用引物Y1和Y2 扩增c-Myb 的DBD和TAD 区基因，即为c-Myb-1基因序列，长度为978 bp；用引物Y1和Y3扩增c-Myb 的DBD 区基因，用引物Y4和Y5扩增c-Myb 的NRD 区前段基因，用引物Y1和Y5 重组PCR 将c-Myb 的DBD和NRD 前段基因扩增到一起，即为c-Myb-2基因序列，长度为833 bp；用引物Y1和Y3扩增c-Myb 的DBD 区基因，用引物Y6和Y7扩增c-Myb 的NRD 区后段基因，用引物Y1和Y7 重组PCR 将c-Myb 的DBD和NRD 区后段基因扩增到一起，即为c-Myb-3基因序列，长度为1160 bp；用引物Y1和Y5 扩增c-Myb 的DBD、TAD和NRD 区的前段基因，即为c-Myb-4基因序列，长度为1230 bp；用引物Y1和Y2 扩增c-Myb 的DBD和TAD 区基因，用引物Y6和Y7 扩增c-Myb 的NRD 区后段基因，用引物Y1和Y7 重组PCR 将这2 段基因扩增到一起，即为c-Myb-5基因序列，长度为1556 bp；用引物Y1和Y3 扩增c-Myb 的DBD 区基因，用引物Y4和Y7 扩增c-Myb 的NRD 区基因，用引物Y1和Y7 重组PCR 将c-Myb 的DBD和NRD 区基因扩增到一起，即为c-Myb-6基因序列，长度为1526 bp。将上述6 段PCR扩增片段与pcDNA3.0-FLAG 分别酶切、回收、连接、转化后，挑取单克隆PCR鉴定，阳性克隆提取质粒后进行双酶切鉴定，结果c-Myb-1～c-Myb-6酶切条带均在预期大小位置出现（图2）。将酶切鉴定为阳性的克隆测序，测序结果与预期序列一致，说明c-Myb各突变体构建成功。

图1 c-Myb野生型和截短突变体结构图

2.2 c-Myb突变体的表达鉴定

将c-Myb的各截短突变体阳性克隆提取质粒后转染293T 细胞，阴性对照转染pcDNA3.0-FLAG 空载体，阳性对照转染pcDNA3.0-FLAG-Myb，48 h 后收集细胞，裂解后用HRP-FLAG 抗体进行Western印迹检测，用GAPDH 抗体检测内参。结果显示，野生型c-Myb和各截短突变体在膜上相应位置均检测到明显条带，表明各c-Myb突变体均可表达（图3）。

2.3 c-Myb 各突变体对c-Myb 下游靶基因c-Myc 表达的影响

用野生型c-Myb和c-Myb 各突变体分别转染乳腺癌细胞株MCF-7，6 h后换液，在37℃培养48 h后收集细胞，裂解后做Western 印迹，结果见图4。相比于野生型c-Myb，含有TAD 区的突变体c-Myb-1、c-Myb-4、c-Myb-5 都能够促进c-Myc 的表达，而不含TAD 区的突变体c-Myb-2、c-Myb-3、c-Myb-6 则对c-Myc 没有促进作用。说明c-Myb 对c-Myc 的调控发生在c-Myb 的转录调控区，而DNA 结合区和负调节区则没有对c-Myc的调控作用。

图2 c-Myb各突变体重组质粒的KpnⅠ/XhoⅠ双酶切电泳图谱

图3 Western印迹检测c-Myb及各突变体在293T细胞内的表达

图4 Western印迹检测MCF-7细胞中c-Myb及c-Myb各突变体对内源c-Myc表达的影响

3 讨论

c-Myb 包含DBD、TAD、NRD 等3 个结构域和1个亮氨酸拉链，在本研究中，我们构建了不同结构域的截短突变体，突变体均以DBD 为基础，加上TAD或NRD，并在乳腺癌细胞中检测了上述突变体对c-Myb 下游基因c-Myc表达水平的调节，发现含有转录激活区的突变体均能上调c-Myc 的表达，说明c-Myb 对c-Myc 表达的促进作用依靠c-Myb 的TAD 区来执行。c-Myb 对其他下游靶基因的调节是否也依赖于TAD结构域，还须实验来证明。

c-Myb 在乳腺癌的发生发展中发挥重要作用，在所有雌激素受体（ER）阳性的乳腺癌细胞中，c-Myb 均高表达[15-16]，c-Myb 是雌激素受体阳性乳腺癌细胞增殖所必需的，在对化学诱导的乳腺癌细胞分化中，c-Myb 的表达被下调，显示了c-Myb 下调增强了乳腺癌细胞的分化和凋亡[17]。ERα和c-Myb 在乳腺癌细胞中的异常表达和相互作用，提示c-Myb 参与了雌激素诱导的乳腺癌发生、发展、演变等诸多过程[18]。本研究以乳腺癌细胞为模型，证明c-Myb 的TAD 结构域能够升高乳腺癌细胞中c-Myc 的表达，由于ERα也能够促进c-Myc 的表达，因此，c-Myb 对c-Myc 的调控是否需要ERα的参与，以及c-Myb 直接调控还是通过ERα间接调控c-Myc，还须进一步的实验证实。

构建c-Myb 不同结构域的突变体，深入探讨c-Myb 不同结构域的功能，有利于研究c-Myb 在恶性肿瘤中发挥功能的分子机制，能够更明确c-Myb 作为成药靶点的区域和调节作用，对于研发特异性高，毒性低的抗肿瘤靶向新药具有重要意义。

[1]Kobe B,Deisenhofer J.Crystal structure of porcine ribonuclease inhibitor,a protein with leucine-rich repeats[J].Nature,1993,366(6457):751-756.

[2]Weinstein Y,Ihle J N,Lavu S,et al.Truncation of the cmyb gene by a retroviral integration in an interleukin 3-dependent myeloid leukemia cell line[J].Proc Natl Acad Sci USA,1986,83(14):5010-5014.

[3]Thompson M A,Ramsay R G.Myb:an old oncoprotein with new roles[J].Bioessays,1995,17(4):341-350.

[4]Schomburg C,Schuehly W,Da Costa F B,et al.Natural sesquiterpene lactones as inhibitors of Myb-dependent gene expression:structure-activity relationships[J].Eur J Med Chem,2013,63:313-320.

[5]Bechard M,Dalton S.Subcellular localization of glycogen synthase kinase 3 beta controls embryonic stem cell self-renewal[J].Mol Cell Biol,2009,29(8):2092-2104.

[6]Minghetti P P,Norman A W.1,25(OH)2-vitamin D3 receptors:gene regulation and genetic circuitry[J].FASEB J,1988,2(15):3043-3053.

[7]陈蕊,张莹,赵丽.c-Myc 与c-myb 基因在白血病中的研究进展[J].肿瘤防治研究,2011,38(10):1207-1210.

[8]Wang M,Wei X,Shi L,et al.Integrative genomic analyses of the histamine H1 receptor and its role in cancer prediction[J].Int J Mol Med.2014,33(4):1019-1026.

[9]Nesbit C E,Tersak J M,Prochownik E V.MYC oncogenes and human neoplastic disease[J].Oncogene,1999,18(19):3004-3016.

[10]Li Z,Van Calcar S,Qu C,et al.A global transcriptional regulatory role for c-Myc in Burkitt's lymphoma cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(14):8164-8169.

[11]Wilson A,Murphy M J,Oskarsson T,et al.c-Myc controls the balance between hematopoietic stem cell self-renewal and differentiation[J].Genes Dev,2004,18(22):2747-2763.

[12]Hock H,Hamblen M J,Rooke H M,et al.Gfi-1 restricts proliferation and preserves functional integrity of haematopoiet-ic stem cells[J].Nature,2004,431(7011):1002-1007.

[13]Guo Y,Niu C,Breslin P,et al.c-Myc-mediated control of cell fate in megakaryocyte-erythrocyte progenitors[J].Blood,2009,114(10):2097-2106.

[14]Greig K T,Carotta S,Nutt S L.Critical roles for c-Myb in hematopoietic progenitor cells[J].Semin Immunol,2008,20(4):247-256.

[15]Cesi V,Casciati A,Sesti F,et al.TGFβ-induced c-Myb affects the expression of EMT-associated genes and promotes invasion of ER+breast cancer cells[J].Cell Cycle,2011,10(23):4149-4161.

[16]Mitra P,Pereira L A,Drabsch Y,et al.Estrogen receptor-α recruits P-TEFb to overcome transcriptional pausing in intron 1 of the MYB gene[J].Nucleic Acids Res,2012,40(13):5988-6000.

[17]Drabsch Y,Robert R G,Gonda T J.MYB suppresses differentiation and apoptosis of human breast cancer cells[J].Breast Cancer Res,2010,12(4):R55.

[18]Edavana V K,Penney R B,Yao-Borengasser A,et al.Fulvestrant up regulates UGT1A4 and MRPs through ERα and c-Myb pathways:a possible primary drug disposition mechanism[J].Springerplus,2013,2:620.