毛细管电泳在β地中海贫血中的应用研究

游雪云，刘艳秋，吴敏

(1、江西省妇幼保健院产前诊断中心，江西 南昌330006；2、临川区第一人民医院检验科，江西 临川344100)

据世界卫生组织1995年统计，世界人口的1.6%是β地贫基因携带者,中国是世界高发区之一，β地中海贫血 (β-thalassemia,以下简称β地贫)，是由于β珠蛋白基因突变或缺失导致β珠蛋白链合成受抑而引起的遗传性溶血性贫血。我国人口基数大，残疾儿发生率高，β0纯合子或双重杂合子为致死性异常，β0杂合β+是症状严重的存活型地贫，虽大部分能适应基本社会生活，但由于长期慢性溶血性贫血，导致患者肝脾肿大，生活质量极差。目前对本病缺乏有效的治疗方法，筛查是预防重症地贫儿出生的最好途径，而毛细管电泳能够定量检测HbA、HbF、HbA2含量，可以有效地筛查出高危夫妇[1]；同时毛细管电泳具有快速、方便、所需样本量少等优点。

毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)又叫高效毛细管电泳，是80年代初发展起来的一种新型分离分析技术，它是电泳与层析相结合的一种分离方法。为了解全自动毛细管电泳系统在β地贫筛查中的临床应用价值，本研究对986例标本分别采用毛细管电泳和琼脂糖凝胶电泳 (agarose gel electrophoresis，AGE)进行检测，并与基因诊断结果进行比较，分析两种方法的灵敏度和特异度，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2010年10月至2013年9月来我院进行产检、婚检或体检的人群，年龄20至40岁之间，大致可分为4类：①血常规检查发现MCV或MCH减少；②红细胞脆性筛查<60%；③家庭中有地中海贫血携带者；④夫妇中有一方为地贫携带者而另一方主动要求筛查的，以上人群共计986例。分别进行毛细管血红蛋白电泳和琼脂糖凝胶血红蛋白电泳检测，并采用分子生物学技术进行地贫基因检测。

1.2 仪器与试剂 毛细管电泳采用法国Sebia公司生产的Minicap全自动毛细管电泳仪及其配套血红蛋白电泳试剂盒、质控品(SEBIA，PN 4778)。琼脂糖电泳采用法国Sebia公司生产的Hydrasys Lc电泳仪，及配套的EPSON系统扫描仪。地贫基因诊断试剂盒由深圳益生堂生物企业有限公司生产提供。血常规测定用日本光电6318K全自动血细胞分析仪。

1.3 方法 986例血标本分别进行毛细管区带电泳及琼脂糖血红蛋白电泳检测。(1)全自动血细胞分析仪平行分析平均红细胞体积(MCV)、平均血红蛋白浓度 (MCH)、血红蛋白 (Hb)、细胞分布宽度(RDW)。(2)毛细管电泳检测：将抗凝血标本离心沉淀，弃除上层血浆，把装有血细胞的试管按顺序放在仪器配套的转盘上(位置1～26)，在转盘的第27管位置加入装有溶血剂的试管，约3h后全部检测程序完毕，查看结果。(3)琼脂糖血红蛋白电泳检测：标本进行洗涤、溶血制作溶血液；点样；选择相应程序进行电泳;30min仪器自动完成电泳、烘干等步骤；电泳完毕及时取出胶片，放入仪器染色单元，选择相应程序，仪器自动进行冲洗、染色、脱色、烘干等步骤；染色结束，取出胶片，用配套的Hyrys系统扫描出结果。(4)17种β地贫基因 (41-42、71-72、IVS-II-654、 -28、17、B∑、31、43、 -32、27／28、-29、3O、14-15、CAP、Int、IVS-I-1、IVS-I-5)分析采用反向斑点杂交技术(RDB)进行分析检测。

1.4 判断标准[2,3]血红蛋白电泳：正常成人HbA2为2.5%～3.5%，并且没有出现异常血红蛋白带。如出现 HbA2≥3.5%和(或)出现 HbF＞2.0%，和(或)异常血红蛋白则判为β地中海贫血表型阳性。

1.5 检测评价指标 灵敏度(sensitivity，Se)=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度(specificity，Sp)=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%。

1.6 统计学分析 采用SPSS 11.5统计软件包对数据资料进行分析，两样本比较用Wilcoxon秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 琼脂糖凝胶电泳和毛细管电泳分析检测结果986例标本中琼脂糖凝胶电泳检出β地贫32例(含HbE 4例)，检出率3.2%，其中2例同时合并HbF增高，检出异常Hb8例。毛细管电泳系统共检出β地中海贫血35例，检出率3.5%，其中HbE增高6例，HbA2和HbF同时增高3例；检出异常Hb9例。两种电泳结果对照之后我们发现：琼脂糖凝胶电泳检出β地贫32例与毛细管电泳结果完全一致，但由于琼脂糖凝胶电泳对HbE和HbA2区带也不容易单独区分，故漏检了2例HbE，另外还漏检了1例HbCS。将两种血红蛋白电泳结果通过列表分析确定以HbA2≥4.8%为筛查β地贫截断值，而两种血红蛋白电泳对986例标本检测的同时均采用PCR结合反向斑点杂交法RDB法[4]做进一步基因诊断；以此基因诊断结果为金标准 ，然后分别对两种血红蛋白电泳检测β地贫表型阳性的灵敏度和特异度结果进行分析。结果表明毛细管电泳诊断β地贫灵敏度和特异度分别为82.3%和87.6%，琼脂糖凝胶电泳诊断β地贫灵敏度和特异度分别为77.6%和81.7%，毛细管电泳检测的灵敏度和特异度均高于琼脂糖凝胶电泳。

2.2 两种电泳检测与基因检测结果比较 986例标本中，毛细管电泳对35例β地贫检出与基因检测(PCR结合反向斑点杂交)结果吻合，而这35例β地贫标本通过琼脂糖电泳有3例与基因检测结果不吻合，其他标本两种电泳结果均一致。但两种电泳均无法发现β地贫中合并的α地贫，反向斑点杂交诊断为β地贫的35例携带者的基因型分别为：CDs41／42(-TCTT)／N 6 例，-28(A→G)／N 6 例，IVS-2—654(C-T)/N 9 例，CDl7(A→T)／N 5 例，CD43(G→T)／N 2 例，CDs71／72(+A)／N 1 例；诊断为HbE的6例携带者的基因型均为CD26(G→A)／N。两种电泳检测与基因诊断结果的符合率见表1。

表1 两种电泳检测后通过基因确诊的β地贫符合率

3 讨论

按照受累的氨基酸链来分类，地贫主要有α地贫(α链受累)和β地贫(β链受累)，全球每年约有超过26000例β地贫患者产生[5],在南方高发地区的人群基因携带率达3%～l0%[6]。β地贫可分为重型、中间型、轻型和静止型基因携带者[7]，地贫在我国南方地区发病率很高，其中广西、广东、江西、四川发病率分别高达 14.95%、4.11%、2.60%、1.92%。而随着流动人口的不断增加及医务人员对地贫的逐渐认识和重视及地贫的检出率也逐年上升。国内外研究[8]结果表明，在地贫高发区，通过遗传筛查、遗传咨询和产前诊断选择性淘汰重症地贫胎儿，是现实条件下控制重症地贫胎儿出生的首要选择。为了减少地中海贫血的发病率，江西省妇幼保健院于2010年开始把地中海贫血筛查作为一项常规检测项目，对检测为高风险的对象建议做进一步基因诊断，从而降低重症患儿的出生率。

β地贫主要表现为HbA2、HbF增高或出现异常血红蛋白，这些异常Hb分子量和所带电荷不同于正常Hb，可利用电泳方法加以分离[9]。本文通过全自动毛细管电泳法检出β地贫表型阳性35例，而琼脂糖凝胶电泳法检出32例，主要原因是全自动毛细管电泳法与琼脂糖凝胶电泳法相比，在血红蛋白区带分辨上还具有以下优点：(1)HbE在琼脂糖凝胶电泳中的表现为在HbA2前后出现淡染的区带，而导致扫描不易显示HbE带，需要操作人员凭经验判断，如经验不足则易漏诊。而毛细管电泳是利用415 nm波长直接检测各组分的百分比，不需要染色，不会将HbE和HbA2发生重叠而影响结果，所以不会出现检测不出而导致漏诊的情况。(2)本研究还发现全自动毛细管电泳检出的3例 HbCS中琼脂糖凝胶电泳仅能检出2例,表明毛细管电泳对微量的异常血红蛋白检出率更高，定量更准确，在检测各种异常血红蛋白比琼脂糖凝胶电泳更具明显优势。另外琼脂糖凝胶电泳对HbF＜2.0%的HbF无法定量，只能扫描出HbA+HbF的量，这与陈星等[10]报告的结果基本相符。而全自动毛细管电泳则能直接检测出HbF的准确百分比。毛细管电泳可直观显示HbF、HbCS、HbE的异常区带，对HbF、HbE、HbCS等分辨力较高，可很好地检测出这些异常Hb含量，并能够直接检测出准确百分比。国外已有毛细管电泳技术应用于诊断地中海贫血的研究报导[11-14],由此可见毛细管电泳在灵敏、快速、准确等方面具有明显优势。

本研究结果显示两种电泳方法筛查β地贫表型阳性的灵敏度和特异度都较高，但毛细管电泳系统检测β地贫表型阳性符合率高于琼脂糖血红蛋白电泳，可见在地贫筛查中毛细管电泳是一种敏感度和精确度更高的分析方法。地中海贫血的筛查关系到本地区人口出生素质,目前在欧洲的一些地区，β-地中海贫血的产前筛查及产前诊断已作为常规项目开展，极大地减少了当地地中海贫血患儿的出生。我院自开展地中海贫血筛查后也几乎没有重度地中海贫血儿的出生，说明只要重视地中海贫血的产前筛查及产前诊断，可以大大减少重度地中海贫血患儿的出生。坚信不久的将来遗传病儿一定能有效控制，我国人口质量将得到相应的提高。

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