南昌地区2例Rh部分D血型的基因背景分析

钱献，杨南

(南昌市中心血站，江西 南昌 330025)

Rh血型系统是目前已被确认的30个红细胞血型系统中最具复杂性和多态性的血型系统，其临床意义仅次于ABO血型系统[1]。Rh血型系统中D抗原的免疫原性强于其他Rh抗原 (E、c、C、e)，大多数RhD阴性的患者，经一次输注RhD阳性的红细胞即可产生RhD抗体，导致溶血性输血反应和自身免疫性溶血性贫血[2]。胎儿RhD阳性红细胞进入RhD阴性母体血液循环，可导致母体产生抗D抗体，发生新生儿溶血病。RhD抗原存在多种变异体，其人群经基因型分析，可表现多种基因变异，临床免疫反应呈现多样性。根据红细胞与抗D的凝集反应强度、基因变异方式、所在位置，以及对抗原表位的影响，RhD变异体可分为部分D(partial D)、弱 D(weak D)和 DEL(Del)表型。 为此，我们对南昌地区献血人群RhD阴性个体进行RhD变异体分子背景研究，通过PCR和测序分析2例南昌地区汉族人弱D表型个体的基因组DNA，观察到1例DVa(Hus)和2例DVIⅢ，并阐明了DVa(Hus)表型个体RHD基因的断裂点，报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选自本血站2012年5月至2013年5月献血者24 337人，用EDTA-K2抗凝真空采血试管留取5mL全血标本(剔除重复献血)，使用单克隆抗D-IgM(加拿大 Biologicals公司)，采用 120孔梯度微量板法获得的无血缘关系RhD阴性标本85例。

1.2 弱D阳性表型确认 对85例初筛阴性标本使用3种IgG型抗D试剂采用间接抗人球蛋白试验(IAT)鉴定，2 例样本(样本 a、b)经鉴定为阳性，据此确定为弱 D。2例样本的 RhC、c、E、e表型使用单克隆 IgM抗体 (抗-C:MS24、抗-E:MS12、抗-c:MS33、抗-e:MS16)试剂(德国 Immucor公司)鉴定。

1.3 弱D样本的RHD基因分析 为了分析2名弱D表型的分子序列，采用序列特异性引物PCR方法(SSP-PCR)同时分析RHD和RHCE基因，以测定RhCcEe表型和检测RHD基因外显子 (Exon)[3]。采用D基因序列分析方法[4]分析RHD基因编码区全长序列，测序PCR产物纯化后(美国Millipore公司)，直接应用BigDyeTMTerminator Cycle标准方法在ABI PrismTM测序仪上进行序列测定 (美国Applied Biosystems公司)。

1.4 DVa(Hus)表型个体D/CE基因交换接点分析根据测序结果，针对第4内显子(Intron)设计了样本a 的 1 对引物：上游引物(Forward Primer)，5’-AACGATACCCAGTTTGTCTG-3’，D 特异性，位置 Exon 4 606-625；下游引物(Reverse Primer)，5’-ATGACCCTGAGATGGCTGT-3’，D/CE特异性，位置Exon 5 769-751。第 5 Intron 扩增引物(D5b-U2，D6-L)[4]，扩增样本a的第4、5 Intron。PCR扩增体系25μl：其中 DNA模板 1μl；DNA聚合酶 1U(美国AppliedBiosystems公司)；dNTPs200μM；MgCl21.5mM；6.25pmol/条引物以及 10×PCR 缓冲液。PCR扩增反应条件：30个cycle(Intron4)，40个cycle(Intron 5)。 95℃变性 10min；94℃ 20s，58℃ 30s，72℃2min(Intron 4)，5min(Intron 5)；72℃延伸 5min。 PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，PCR产物或切胶提取的目的条带DNA产物(Intron 4)，按照前面的方法进行纯化测序。

1.5 基因序列结果用软件Chromas和DNAMAN(美国Lynnon)联合分析。

2 结果

2.1 SSP-PCR分析结果 样本a第5 Exon检测为阴性，其他 Exon(第3、4、6、7、9、10Exon)均为阳性；样本b第3～6Exon为阴性，而第 7、9、10 Exon为阳性。RHCE基因序列检测显示样本a为ccEe，样本b为Ccee，检测结果与血清学检测结果一致。

2.2 DVIⅢ型鉴定结果样本b的测序PCR结果均显示缺失D基因第3～6Exon，序列分析b样本的第1、2Exon和第7～10Exon，结果显示基因序列与正常D基因序列是相同的(GenBank acc.no.AJ299020-1和AJ299026-9)，这就证明样本b具有融合等位基因RHD-CE(3-6)-D[4]特征。基因分析与血清学鉴定提示这例样本为部分DVIⅢ型，存在于单倍体CDe[5]。

2.3 DVa(Hus)型D基因分析结果 样本a的测序PCR结果显示RHD基因的所有10个Exon均为阳性，序列分析则表明样本a的RHD基因第1～4Exon和第6～10Exon与正常RHD基因(GenBank acc.no.AJ299020-3和AJ299025-9)一致，因为第5Exon的全部序列却与RHCE基因(RHE，676C)相同，根据此结果可判定样本a为部分D表型DVa(Hus)型，融合基因为 RHD-CE(5)-D[6]，单倍体为cDE。第4Intron的全部序列与RHD基因的第4Intron完全相同，而第5Intron的序列特异性与RHCE基因相同，同时存在7个多态性位点(Gen-Bankacc.no.AY330698)：23-25(GCA)2，98G>A，168-169insG，205-206insT，494-495insA，1256-1257insC，1347G>T。由此可以得出结论，融合DVa(Hus)等位基因在第5 Exon和第5 Intron发生RHD/CE基因交换(图1)。

图1 DVa基因结构示意图

2.4 RHD基因数目分析结果 2名个体均存在单条D基因，为RHD+/RHD-杂合子。样本a基因型为cDVaE/cde，样本b和c基因型为CDVIe/cde。

3 讨论

Rh血型是输血医学重要的血型系统，Rh抗原特别是D抗原具有很强的免疫原性，其高度复杂的免疫遗传学特性而成为输血医学领域最重要的研究内容。正常红细胞膜D抗原血清学鉴定包括至少9个抗原表位[1]，弱D/部分D表型是由于RHD基因编码区单个碱基的突变导致跨膜区或胞内相应氨基酸的改变,从而使Rh(D)抗原表达密度下降，目前主要通过具有抗不同D抗原表位活性的单克隆抗体[2]进行血清学鉴定，在中国汉族人中，有报道频率从0.0089%～0.015%不等[6]。部分D表型个体的D抗原位点数目在不同个体间会存在差异，不排除会有些部分D个体被敏感的IgM+IgG抗-D检测为D阳性个体的可能。

南昌汉族人群中发现的DVa(Hus)表型个体的第5(676C)Exon，假如发生基因顺式交换，那么中国人中存在DVacE单倍体。有研究报道DVa(Kou)、DVa(FK)、DVa(TO)和 DVa-like(YH)表型的 RHD/CE 基因在第5 Exon只是小片段基因交换[6]，DVa(Hus)在高加索人中只进行了mRNA的分析[7]，基因组DNA分析证实DVa(Hus)的RHD基因的第5 Exon和第5 Intron共约1800个核苷酸被RHCE基因替换，其RHD基因的交换接点在第5 Exon的5’端和第5 Intron的 3’端。

中国汉族人群中约有0.2%～0.5%的人常规血清学初筛为RhD阴性，这部分RhD阴性的人经进一步间接抗人球蛋白试验和吸收放散试验查证，约20%～30%为RhD变异体,并非真正的RhD阴性个体。熊莉等[8]对江西地区154例 RhD阴性表型个体进行RHD基因多态性分析，发现Exon完全缺失占55.84%，部分缺失占20.78%，检出Del RhD1227A、弱 D15 型、RHD-CE(2～9)-D、DVa(Has)、DⅥⅢ等多种RHD血清学阴性RHD等位基因。因此能不能准确检出RhD变异体对安全输血有重要的意义，本血站在RhD阴性的人群中开展RhD变异体表现型和基因型的研究，探讨本地区RhD变异体基因型的分布规律，以及临床应对措施，建立健全RhD变异体人群的基因型档案，最大限度地避免输血不良反应的发生和宝贵的RhD阴性血的资源浪费。

[1]陈家学,杨仕坤,石思蓉,等.常规血清学RhD阴性个体D基因多态性的种族差异[J].临床血液学杂志,2011,24(12):757-759.

[2]周志方,杜勤,刘海英,等.弱D型输血致产生抗-D抗体引起输血不合一例[J].中华检验医学杂志,2004,27(1):16.

[3]Lan JC,Chen Q,Wu DL,et al.Genetic polymorphism of RhD-negative associated haplotypes in the Chinese[J].JHum Gene,2000,45(4):224-227.

[4]Legler TJ,Maas JH,Kohler M,et al.RHD sequencing:a new tool for decision making on transfusion therapy and provision of Rh prophylaxis[J].Transfus Med,2001,11(5):383-388.

[5]金辉,张一兵,佟青,等.Rh血型弱 D和DEL表型的基因突变分析[J].基础医学与临床,2012,32(4):447-450.

[6]Wagner FF,Gassner C,Muller TH,et al.Three molecular structures cause rhesus D category VIphenotypes with distinct immunohematologic features[J].Blood,1998,91(6),2157-2168.

[7]孙国栋,段现民,伊志柱,等.华北地区汉族人群RHD抗原弱表现型个体的分子遗传机制研究[J].中国输血杂志,2007,20(2):108-112.

[8]熊莉,孙瑜,李国良,等.154例RHD阴性表型个体的D基因多态性分析[J].实验与检验医学,2014,30(4):340-341.