萍乡地区孕妇产前地中海贫血筛查及基因诊断

刘红宇，王繁，甘建玲，何蓉，邓思媛，欧阳宁

(萍乡市妇幼保健院生殖遗传研究室，江西 萍乡337055)

地中海贫血(thalassemia简称地贫)是人体珠蛋白基因缺失或突变而引起的一种遗传性溶血性贫血，是我国南方最常见的遗传性疾病[1，2]。在我国常见于广西、海南、广东、福建、香港、台湾、云南、贵州、四川等地区。地贫目前尚无确切有效的治疗方法，重型α-地贫多为死胎且孕妇并发妊娠高血压综合征，重型β-地贫需要终身依赖输血和使用祛铁剂，而中间型α和β地贫患者多无劳动能力或劳动力下降[3,4]，给家庭和社会带来沉重的经济负担。因此，采用红细胞平均体积MCV(mean corpuscular volume),平均红细胞血红蛋白量MCH(mean corpuscular hemoglobin)和血红蛋白电泳对孕妇进行地中海贫血筛查，缺口聚合酶链反应(Gap-PCR)法、聚合酶链反应－反向斑点杂交法(PCR-RDB)对高危胎儿进行产前基因诊断进行基因检测。是预防重型地中海贫血患儿出生的重要措施和方法[5]。

1 材料与方法

1.1 标本来源 2013年10月至2014年1月在我院妇保科产检的孕妇及其丈夫共1345例，同时进行血常规和血红蛋白电泳分析，并对164例地贫表型阳性者进行基因诊断。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 MCV和MCH测定 采用日本希森美康Xi800全自动血细胞分析仪及其配套的稀释液和溶血素试剂测定，实验前严格按照操作规程进行质控，标本为2ml EDTA-K2静脉抗凝血。

1.2.2 血红蛋白电泳分析 采用法国Sebia公司的全自动血红蛋白电泳仪和按照配套的说明书进行操作。

1.3 地贫表型阳性诊断标准

1.3.1 α地贫表型筛查阳性 MCV<80 f1[6]，MCH<27pg，Hb A2<2.5%，Hb F<2%，其中一项阳性者。

1.3.2 β地贫表型筛查阳性 MCV<80f1，MCH<27pg，Hb A2>3.5%，Hb F>2%，其中一项阳性者。 对α或β地贫表型筛查阳性患者，重新抽取2ml EDTA-K2静脉抗凝血做基因诊断。

1.4 检测方法 地中海贫血的基因诊断α和β地贫试剂盒由亚能生物技术 (深圳)有限公司提供。PCR扩增仪为HEMA9600。

1.4.1 α地贫基因缺失型诊断采用Gap-PCR法检测-αSEA，-α3.7和-α4.2三种α珠蛋白基因常见缺失型。α地贫点突变型诊断采用PCR斑点反向杂交法 (PCR-RDB)检测三种点突变型，包括Hb WS:CD122(CAC→CAG),Hb QS:CD125(CTG→CCG),Hb CS:CD142(TAA→CAA)。

1.4.2 β地贫基因突变型采用PCR-RDB检测17种β常见突变型 CD41-42(-TTCT)，IVS2nt654(C→T)，-28(A→G)，CD17(A→T)，CD71-72(+A)，-29(A→G)，βE(GAG→AAG)，CD43(G→T)，CD27/28(+C)，CD14-15(+G)，CD31(-C) ，-32(C→A) ，-30(T→C)，IVS-Ⅰ-5(G→C)，CAP[CAP+1(A→C)/nts40-43(-AAAC)]，Int(ATG→AGG)。

2 结果

2.1 地贫表型阳性检出率 在1345例病人中检出地贫表型阳性者共164例，阳性率占12.19%。其中α地贫表型阳性者73例，占44.51%，β地贫表型阳性者91例，占55.49%。

2.2 地中海贫血基因诊断的确诊例数 164例表型阳性的孕妇及其丈夫经基因诊断后，确诊为地贫患者58例，其中α地贫18例，β地贫40例。

2.3 地中海贫血基因诊断的确诊率中α和β各型所占比例 在18例α地贫中--αSEA/αα杂合子16例，占 88.89%，-α3.7/αα 地贫杂合子 0例，占 0%，-α4.2/αα地贫杂合子2例，占11.11%，见表1。

表1 α地贫杂合子基因型(%)

在40例β地贫中CD41-42杂合子15例，IVS2nt654杂合子10例，CD17杂合子6例，-28(A→G)6例，CD71-72(+A)2例，-29(A→G)1例，这40例β地贫患者，共有6种类型β珠蛋白基因突变发生，见表2。

表2 β珠蛋白基因突变构成比(%)

3 讨论

地中海贫血分布于世界许多地区，东南亚是高发区之一，其中中国以广东、广西、四川、海南多见，常见的类型α地贫和β地贫，据现有流行病学调查资料显示，以上地区人群中α地贫发生率高达4～15%；β地贫约1～6%。地贫危害最严重的临床类型是Hb Bart’s胎儿水肿综合征、重型β地贫、中间型β地贫和血红蛋白H病。

3.1 萍乡地区地中海贫血的筛查 在萍乡地区1345例筛查夫妇中，地贫表型阳性检出率为12.19% ，其中α地贫表型阳性检出率为44.51%，β地贫表型的阳性检出率为55.49%，在我院的产检人群当中，血常规的MCV和MCH常作为地贫筛查指标，表型阳性者再进行血红蛋白电泳分析以定量检测Hb A，Hb A2和Hb F，电泳阳性者再进行基因确诊实验，以减少漏诊的发生。

3.2 萍乡地区地中海贫血的基因诊断 经α基因缺失型分析后，在萍乡市的孕妇及其丈夫中，东南亚缺失型--αSEA/αα占主导地位，基因构成比占88.89%，-α4.2/αα 地贫，即左侧缺失占 11.11%，右侧缺失很少出现。说明在中国南方地区比如江西省萍乡地区α地贫缺失型主要是东南亚型占大部分，这与有关的研究报道结果相一致[7]。1996年杜传书等人总结了中国人β地贫基因突变频率的高低顺序如下CD41-42(-TCCT)占41.6%，IVS2nt654(C→T)占 21.8%，CD17(A→T)占 18%，β-28(A→G)占 8%，CD71/72(+A)占 3.9%，β-29(A→G)占 1.2%[8]。本文在检测出6种基因突变类型和构成比，大致与之相同。

3.3 萍乡地区地中海贫血各型的分布特点及其结论 迄今为止，中国人中共发现了7种地贫缺失基因， 比较常见的有以下三种：-αSEA/αα，-α4.2/αα，-α3.7/αα。在萍乡地区的1345例产妇及丈夫中，主要是 --αSEA/αα(88.89%)，很少部分为-α4.2/αα(11.11%)。α地贫突变型的6例患者中，无一例异常。说明，萍乡地区α地贫主要以缺失型为主，突变型比较罕见。β地贫主要是突变所导致的，目前中国人群主要有34种突变，亚能生物检测的17种突变类型包括了常见的突变类型。在6例筛查结果显示α和β复合型患者中，无一例是α和β同时存在的。因而防治地贫的主要措施是进行筛查，并通过婚前、孕前或产前筛查出静止型或轻型地贫夫妇，对于重型地贫高危胎儿进行产前基因诊断，阻止该病重症患儿出生是目前国际公认的首选预防对策[9,10]。

[1]Higgs DR,Ayyub H,Chong SS.The-THAI and-FIL determinants of a thalassemia in Taiwan[J].Hematology,1999,60(1):80-85.

[2]杨艳.地中海贫血筛查及基因检测结果分析[J].中国临床新医学,2012,5(12):1159-1161.

[3]张俊武,龙桂芳．血红蛋白与血红蛋白病[M].南宁:广西科学技术出版社,2003:204-235．

[4]Cappellini MD,Cohen A,Eleftheriou A,et al.Guidelines for the dinical management of thalassemia[M].Nicoeia,Cyprus:The Jassaemia International Federation,2007:18-30．

[5]Chong SS,Boehm CD,Higgs DR,et al.Single-tube multiplex-PCR screen for common deletional determinants of a-thalassemia[J].Blood,2000,95(1):360-362.

[6]Chern SR,Chen CP.Molecular prenatal diagnosis of thalassemia in Taiwan[J].Gynecol Obstet,2000,69(11):103-106.

[7]张新华.广西南宁市农村育龄人群地中海贫血筛查及基因型和血液学参数分析[J].中华流行学杂志,2006,27(9):769-772.

[8]杜传书.地中海贫血研究的现状与未来[J].中华医学遗传学杂志,1996,13(5):643.

[9]周玉球,徐湘民.中国人β地中海贫血的分子基础及产前诊断[J].国外医学遗传学分册.1995,18(3):133-136.

[10]曾华,张智贤,倪李佳,等.网织红细胞血红蛋白含量在β-地中海贫血和缺铁性贫血病人中的变化研究 [J].实验与检验医学,2013,31(3):205-207.