金属硫蛋白与糖尿病并发心肌病

邵雨田，牛超，阮丹丹，朱忠欣，金利泰，詹坤高



金属硫蛋白与糖尿病并发心肌病

邵雨田，牛超，阮丹丹，朱忠欣，金利泰，詹坤高

325000 温州医科大学检验医学院生命科学学院

糖尿病（DM）是当今影响人口众多，分布范围广泛的慢性疾病，糖尿病心肌病是其主要的并发症之一。流行病学研究发现，糖尿病患者心血管疾病的发病率较非糖尿病患者高 2 ~ 3 倍。近期研究发现，血糖代谢正常者心力衰竭发病率为 3.2%，而糖代谢异常者（糖耐量减低和空腹血糖受损者）和 2 型糖尿病患者心力衰竭发病率分别是 6.0% 和 11.8%[1]。

1972 年，Ruber 将这种发生于糖尿病患者，不能用高血压性心脏病、冠状动脉粥样化心脏病、心脏瓣膜及其他心脏病变来解释的心肌疾病称为糖尿病心肌病（DCM）[2]。随着发病率的不断增加，DCM 的治疗已经成为众多临床医生和流行病学家亟待解决的问题之一。经过四十多年的研究，人们逐渐发现 DCM 导致的心肌结构、功能、代谢途径改变与氧化应激增加、钙稳态失调、线粒体损伤等因素密切相关[3]。

考虑到金属硫蛋白（MT）的功能和分子特性，尤其是其强大的金属结合能力与自由基清除能力，利用金属硫蛋白的抗氧化作用治疗 DCM 已经成为一种重要的策略[4]。金属硫蛋白化学名为金属硫组氨酸三甲基内盐，是一类在生物界内广泛存在的小分子蛋白质，具有独特的分子特性，包括：①富含半胱氨酸，MT 的氨基酸组成中富含半胱氨酸，且每一个半胱氨酸都能与金属相结合，使 MT 具有强大的自由基清除能力；②高金属含量，可以帮助金属离子的转运，从而调节体内物质代谢和能量代谢；③抗酸抗碱，在体内体外环境中结构较稳定，不易变性；④低分子量，通过饮食摄入 MT，在消化道内能完全被胃肠道吸收并以完整形式转运到组织而不被分解为氨基酸或多肽；⑤高诱导性，可被金属、糖皮质激素、细胞因子等应激因素诱导合成；⑥分布范围广泛，动物、植物、微生物中均存在，且广泛分布于各个组织中；⑦还具有光学特性、半保守性等特点[5-6]。目前，MT 在临床医学、农林业生产、环境监测、食品检测等方面都具有广泛的研究价值和广阔的应用前景。

MT 在 DCM 中的作用机制尚不明确，目前普遍认为与 MT 所具有的强大自由基清除能力、抗细胞凋亡功能以及与金属结合能力等方面有关。随着多种转基因动物模型的开发利用，分离纯化和检测技术的改进，MT 在 DCM 的临床治疗中颇具应用潜力。

1 DCM 与金属硫蛋白

糖尿病诱导的心肌病会损伤心脏结构，使毛细管基底膜（CBM）增厚、间质纤维化、促进细胞衰老和凋亡、主动脉病变等；而且会影响心脏功能，使心脏收缩、舒张功能障碍，影响血液循环；此外，还会改变心脏代谢途径，导致能量代谢异常从而对心脏造成严重的损伤。除高血糖、高血脂、肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAs）活化、心脏自主神经病变外，这些现象与自由基水平升高、钙稳态失调、Akt 异常密切相关[3, 7]。

近年来研究发现，MT 能够通过减少氧化应激，使活性氧自由基（ROS）水平下降；显著减少心脏细胞凋亡、线粒体损伤；从而保护糖尿病初期内皮损伤和毛细血管基底膜增厚及间质纤维化等类似的结构损伤[8]；并缓解心脏收缩舒张功能障碍，调节心脏钙稳态[9]，最终减少糖尿病导致的心脏损伤和肾损伤[10]。

2 MT 保护 DCM 可能的分子机制

2.1 减轻氧化和硝化损伤

DCM 引起的高血糖、高血脂、胰岛素抵抗会使 ROS 或活性氮自由基（RNS）水平失调致使心肌线粒体功能紊乱，一氧化氮合成酶偶联抗氧化防御能力下降[11]，促使存活细胞信号受损和细胞凋亡[12]，进而导致心脏结构重塑和功能衰竭[11]。并且，糖尿病还能够诱导心肌细胞中超氧化物、3-硝基酪氨酸（3-NT）等物质产生，升高体内 RNS 水平[13]，导致糖原合酶激酶（GSK-3β）失活进而影响心脏糖代谢和能量代谢，引发炎症等症状[14-15]。因而，DCM 的抗氧化治疗和抗硝化损伤颇为重要。

相对于其他抗氧化剂来说，MT 作为心肌抗氧化剂具有以下优点：①高效的自由基清除能力，MT 能够高效清除氧自由基（·OH）、过氧阴离子（O2–）等氧化因子且清除能力比谷胱甘肽（GSH）的能力高 340 ~ 800 倍，且远高于过氧化物歧化酶（SOD）、维生素 C（VC）、维生素 E（VE）等其他抗氧化剂[16-17]；②非特异性，由于 MT 的抗氧化能力与其与金属离子结合产生的动力不稳定性有关，因而 MT 与亲电物质的结合不具有特异性，几乎能清除所有氧化产物；③不产生新氧化物质，MT 通过氧化还原循环消耗自由基，维持体内氧化还原平衡；④靶向分布，MT 在心脏、肝脏、脾脏、胃肠道、肾脏等器官中都存在，然而在氧化应激发生时会特异性过表达，在发生氧化应激的部位富集，从而达到靶向分布的效果[18-19]；⑤安全性，MT 抗氧化过程中不影响心肌细胞正常功能表达[9]。

MT 的抗氧化应激机制：一方面，表现为 MT 氧化还原循环（图 1），当环境氧化程度因为某些因素，例如谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSSG）比例增加而减弱，即为低氧化水平时，Zn 结合 MT-硫醇生成 MT；随着在 ROS 或 GSSG 存在下环境氧化程度增加，成为高氧化水平时，MT 在 Se 催化作用下转变为 MT-硫醇结合自由基，Zn 被释放出来作用于蛋白质、脂质等生物大分子。这种循环称为 MT 的氧化还原循环，在维持机体的氧化还原平衡中起着重要作用[18-19]。另一方面，表现为诱导抗氧化有关的酶类产生。

图1 MT 抗氧化应激机制[18-19]

MT 抗心肌硝化损伤可能的机制：除清除 RNS 外，对比 STZ 诱导的糖尿病 WT 鼠和 MT-TG 小鼠还发现由糖尿病诱导的心肌硝化损伤可能与琥珀酰辅酶 A：3-酮酸辅酶 A 转移酶-1（SCOT）硝化 Trp374有关[13]。其具体机制有待进一步深入研究。

氧化应激增加和硝化损伤都会导致细胞凋亡增加，目前主要以 3-NT 为心肌细胞凋亡的生物标志物[20]进行研究，但也可能与 MAPKs 途径或促分裂原激活蛋白激酶（CHOP）表达形式有关[21]。

2.2 维持金属离子稳态

除高糖损伤外，糖尿病还会导致心脏细胞金属离子稳态失衡。MT 作为重金属清道夫不仅能缓解金属离子浓度过高造成的结构损伤，还能通过参与金属离子的转运和代谢，促进金属离子稳态。其中 Zn2+、Ca2+最为典型[10]。

此外，MT 的重金属解毒作用还有助于解除 Cd2+、Cu2+等诱导的细胞毒性，对糖尿病心肌细胞起到了良好的保护作用。

2.3 降低心脏自噬作用

除了细胞凋亡和坏死外，最近研究发现心脏自噬是另一种 DCM 死亡的方式。在正常情况下，细胞自噬往往是一种保护性的应激策略，而 DCM 会导致长期大量的过度自噬，这种情况往往是致命的。在心肌中的表现为通过抑制 PI3K(I)-Akt 信号通路使代谢失调[22]。而 MT 能够影响自噬信号级联使心脏自噬作用降低，从而减少心脏畸形[23]。

3 MT 研究现状与临床应用展望

3.1 动物模型

目前研究MT 对 DCM 的抗氧化治疗所采用的模型包括药物注射模型和转基因模型，主要的实验动物是小鼠，其他还有兔、狗、猪等（表 1）。

表 1 常用动物模型[8]

以上模型的开发与应用为 MT 治疗 DCM 的研究阶段提供了良好的实验基础。

3.2 MT 的诱导、检测和分离纯化

自 1957 年 Valee 发现 MT 以来[24]，MT 的分离、鉴定、纯化、检测技术不断成熟。目前主要采用分子生物学方法和生化分析方法（表 2）[25]。

MT 具有高诱导性，除了能够通过如 Cu2+、Zn2+、Cd2+等金属诱导，也能够通过糖皮质激素、胰高血糖素、肾上腺素等激素诱导，并且 CCl4、阿霉素、阿片类药物、干扰素、细菌内毒素等药物也能够诱导，还能够通过高温、寒冷等物理因素诱导。其诱导机制主要是通过应激作用使 MT 富集。此外，转基因也能够使 MT 特异性过表达。

MT 的检测方法多样，主要包括生物化学方法和分子生物学方法。其中，MT-mRNA 法采用 sqRT-PCR 或 RT-PCR 技术，操作简便，检测速度快，准确度高；而电化学法包括伏安法、计时电位法、极谱法（除灵敏度高外还有助于研究 MT 构型变化及其与金属离子的相互关系）；在此基础上，质谱偶联技术如 ESI-MS、MALDI-MS、ICP-MS 能够进一步研究蛋白特性；另外，金属饱和分析法、巯基显色法、色谱法、免疫化学法等也能用于 MT 的测定。在免疫化学法中，目前 FIA 使用较少，而 RIA 由于检测时间长，准确度较低，需要同位素标记，而逐渐被 ELISA 所替代。免疫印迹法也有助于检测低含量样品。

色谱法包括 HPLC、HPLC-AAS，除检测外还能用于 MT 的分离纯化，其他的分离纯化方法还包括层析法、凝胶过滤法等。

表 2 MT 诱导、检测、分离纯化方法

虽然，目前 MT 的检测方法还缺少统一的标准，检测结果的适当解释也有待于进一步的探讨。但是随着 MT 诱导、检测、分离纯化技术的不断改进，MT 缓解 DCM 及 MT 在人体内的代谢方式将更清晰地展现出来。

3.3 给药方式

由于 MT 独特的分子特性，其治疗糖尿病的给药方式主要分为外源性给药和内源性给药两种。

外源性给药，主要通过口服摄入。一方面，不同于胰岛素，MT 具有分子量小、抗酸抗碱等分子特性，使其在动物体内能够直接被胃肠道吸收并以完整形式转运到组织，而不分解为氨基酸或多肽，通过口服给药以减少注射带来的疼痛和麻烦，然而利用效率较低，往往到达心脏的含量很少。另一方面，通过转录激活因子（Tat）、线粒体苹果酸脱氢酶（mMDH）中的短肽（sMTS）与 MT 融合而成的融合蛋白Tat-sMTS-MT（TMM）被证明能有效改善 DC 诱导的 H9C2 细胞缺氧、高糖、ROS 水平上升等症状，有望成为治疗糖尿病和糖尿病并发症的治疗蛋白，但其具体的作用机制和代谢方式尚不明确[26]。

内源性给药，主要是通过增加体内Zn、糖皮质激素或其他物质的含量以诱导 MT 的产生，从而使体内MT 水平升高的方法。目前认为 Zn 是较好的诱导物质。一方面，Zn 是体内所必需的微量元素之一，不仅能参与体内的各种代谢调节，还是多种蛋白质的组成成分。据报道，糖尿病患者往往出现缺锌的症状，需要一定的外源性补充；另一方面，Zn 具有胰岛素样作用可以帮助调控血糖；并且 Zn 过量导致的毒副作用很小并能通过停止摄入缓解；此外 MT 的抗氧化作用依赖于 Zn 的参与[10]。

综上所述，适当的给药方式将大大增加 MT 在机体中的作用。因而找到一种高效（吸收效率高）、特异性（作用于靶器官心脏）、安全（毒副作用少）、便捷（使用时能尽量不给患者带来痛苦）、经济（成本低廉）的给药方式有待进一步的探索。

4 小结

近年来，科研工作者通过组织水平观察，细胞水平研究，分子水平分析对 MT 在 DCM 中的作用有了较为深入的认识，然而由于 MT 具体的作用机制与代谢途径尚不十分明确，充分认识 MT 对 DCM 作用机制并投入临床应用还需要进一步的研究，如：在作用机制方面，MT 在分子水平上能够减少氧化应激与硝化应激，但其具体过程反应在组织水平中是否会与其他心脏代谢活动相互作用，这些作用进一步会造成怎样的影响，是否会影响其他器官的正常生理活动未有定论；在代谢途径方面，MT 在体内的代谢途径仍不清晰，外源性给药还是内源性给药颇有争议；在分离纯化、检测技术方面，虽然随着生物技术的不断发展，MT 的分离纯化、检测手段越来越多样化，但仍未有统一标准和完善的方法。

这些问题有待于科研工作者们和医学研究者们不断深入地研究和不懈地坚持去发现、去解释、去完善，以至于各个击破。相信在不久的将来，随着对 MT 治疗 DCM 的作用机制的不断认识和 MT 在体内的代谢途径的更为清晰，以及 MT 的诱导、分离纯化、检测技术的日趋完善，MT 治疗 DCM 不仅是一种颇具吸引力的策略，更能辅助临床治疗，减轻 DCM 患者的病痛。

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温州医科大学本专科学生科研课题（WYX201301037）；温州市科技项目（Y20130156）

詹坤高，Email：zkg79512@163.com

2013-11-22

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.02.011