糖皮质激素受体α调节剂高通量筛选模型的建立及应用

孙彩霞，张振亮，郑海洲，路新华，郑智慧，赵宝华，段宝玲



糖皮质激素受体α调节剂高通量筛选模型的建立及应用

孙彩霞，张振亮，郑海洲，路新华，郑智慧，赵宝华，段宝玲

050016 石家庄，河北师范大学生命科学学院（孙彩霞、张振亮、郑智慧、赵宝华）；050013 石家庄，华北制药集团新药开发有限责任公司（郑海洲、路新华、郑智慧、段宝玲）

建立不同分子作用机制的糖皮质激素受体α（GRα）调节剂高通量筛选模型，筛选新型糖皮质激素受体调节剂。

克隆 GRα 的配体结合域 LBD 和全长基因，构建哺乳动物细胞表达载体pBIND-GAL4-GRα LBD、pTARGET- GRα，分别与已构建的含 GAL4 响应元件 5 × UAS 的荧光素酶报告质粒 p5 × UAS-luc 和含有 4 × GRE 的报告质粒 pGRE-luc 共转染 HeLa 细胞，建立两种不同机制的报告基因细胞筛选方法，通过报告基因的表达检测化合物对 GRα 受体转录调控功能的调节剂作用；利用实时定量 PCR 方法进一步验证化合物对糖皮质激素受体靶基因 mRNA 水平的调控作用。

经过分别共转染表达质粒和报告质粒，GRα 激动剂地塞米松可剂量依赖地诱导 5 × UAS-luc 和 4 × GRE-luc 两个模型的荧光素酶的表达，在 5 × UAS-luc 模型中，最大上调倍数可达（9.0 ± 0.2）倍，EC50值为（0.28 ± 0.07）mmol/L，Z' 因子为 0.52。在 4 × GRE-luc 模型中，最大上调倍数可达（3.2 ± 0.3）倍，EC50值为（1.81 ± 0.13）mmol/L，Z' 因子为 0.49。利用模型 pBIND-GAL4-GRα LBD/p5 × UAS-luc 从 2000 多个微生物和植物来源的天然以及合成化合物中筛选得到 1 个微生物来源的天然产物黑麦酮酸D，黑麦酮酸D 对 GRα 具有 2 ~ 3 倍的激动活性。进一步的定量 PCR 的结果说明黑麦酮酸D 能有效上调多个 GRα 调控的靶基因的表达。

两种报告基因筛选方法灵敏、稳定，可以用于 GRα 调节剂的高通量筛选。

糖皮质激素受体 α； 生物应答调节剂； 降血糖药； 高通量筛选

糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，GR）是核受体家族中的重要成员，是一种可溶性单链多肽组成的磷蛋白[1]，也是一种典型的激素依赖性转录调节因子[2]，与激素结合后通过和靶基因中糖皮质激素反应元件（glucocorticoid receptor response element，GRE）相互作用，对靶基因的表达起到调节效果，最终引起各种生物学效应[3-4]。GR 被报道参与机体应激反应，具有抗炎、免疫、促细胞凋亡、参与糖代谢等作用[5-9]。GR 的调节剂（激动剂和拮抗剂）被用于哮喘、炎症、免疫、肺栓性肺炎（COPD）、糖尿病等疾病治疗。Horizon 制药公司的强的松，能治疗关节炎、平喘、慢性梗阻性肺部疾病并且有止痛作用。目前国际上仍有制药公司进行新的 GR 调节药物的研究开发。

本研究为了发现和研究新的 GR 调节剂，研制和开发新的 GR 调节剂候选药物，基于 GR 的作用机制，利用分子生物学技术建立了细胞水平报告基因 GRα（GR 的一种亚型）调节剂高通量筛选模型[10]。本文主要对筛选方法的建立、验证及筛选结果进行报道。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、菌种和细胞株 pGEM-T easy 载体购于美国 Promega 公司；pBIND 启动子载体、 pTARGET、HeLa 细胞为本实验室保存；GRE-luc 报告质粒购于上海碧云天公司；p5 × UAS-luc 报告质粒为本实验室构建[10]。

1.1.2 主要仪器 GeneAmp PCR System 为美国Backman 公司产品；HERA cell CO2培养箱为美国科峻仪器公司产品；1420 Victor2 多标计数仪为美国 PE 公司产品；ABI Prism 7000 real time PCR 仪为美国 ABI 公司产品。

1.1.3 工具酶与主要试剂 Ex-Taq、DL2000 分子量标准、λ-DNAd III分子量标准、DNA Ligation Kit、SYBR Premix EX Taq 购于宝生物工程（大连）有限公司；限制性内切酶H I、I、Luciferase Assay System 购于普洛麦格（北京）生物技术有限公司；QIAGEN-tip100 购于德国Qiagen 公司；新生牛血清购于浙江天杭生物科技有限公司；PRMI 1640 培养液购于美国Hyclone 公司；无酚红 PRMI 1640 培养液购于美国Gibco 公司；lipofectamine 2000、Superscript II反转录酶购于美国 Invitrogen 公司；人脑海马回总 RNA 购于美国Clontech 公司；地塞米松购于天津天药药业股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 GRα LBD 片段和全长片段的扩增 用 Superscript 反转录试剂盒对人脑海马回总 RNA 进行反转录，再以 cDNA 为模板进行 PCR，GRα LBD 基因的上游引物和下游引物分别为：5' A GAGGATCCATGTTCCTGCAAC 3'，5' TCCGGTA CCTCACTTTTGATGA 3'。GRα LBD 片段 PCR 扩增程序：95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min 10 s，30 个循环；72 ℃延伸 10 min；反应终止于 4 ℃。GRα 全长序列的上游引物和下游引物分别为：5' ATTGGAT CCTTGCCGCCACCATGGACTCCAA 3'，5' ACCGG TACCTCACTTTTGATGAAACAGAAGTT 3'。GRα 全长序列的 PCR 扩增程序：95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性 30 s，58 ℃退火 35 s，72 ℃延伸3 min 10 s，30 个循环；72 ℃延伸10 min；反应终止于 4 ℃。

1.2.2 pBIND-GRα LBD、pTARGET-GRα 质粒的构建、转化和提取 将 PCR 产物连接到 pGEM-T easy 载体，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将序列正确的 GRα LBD 基因片段用HI、I双酶切并与 pBIND 载体连接，然后进行I、HI双酶切鉴定。将序列正确的 GRα 全长基因序列用HI、I双酶切并与 pTARGET 连接，然后进行I、HI双酶切鉴定。并用 QIAGEN-tip 100 对两种质粒进行大量提取并电泳检测，以 260 和 280 nm 处的值进行质粒的定性和定量分析。

1.2.3 细胞培养 用含 10 % 胎牛血清、1 ×105U/L 青霉素和 100 mg/L 链霉素的 PRMI 1640 培养基于37 ℃，5 % CO2培养箱中培养。

1.2.4 瞬时转染和报告基因检测 将待转染的细胞株以 3 × 105个/ml 细胞数接种于 96 孔板，24 h 后将培养液换成含 10% 胎牛血清的无双抗的PRMI 1640 培养基，用 lipofectamine 2000 将重组质粒 pBIND-GAL4-GRα LBD/p5 × UAS-luc或 pTARGET-GRα/GRE-luc 共转染入细胞中。6 h 后加入不同浓度的药物诱导刺激，DMSO 作为空白对照。给药 24 h 后裂解细胞，多标计数仪检测荧光素酶的表达活性。荧光素酶的表达诱导倍增数为加药组的荧光素酶的活性与空白对照（DMSO）的比值。

1.2.5 Z'因子的计算 Z'因子是用于评价高通量筛选方法稳定性的一个重要参数，计算公式如下：

Z' 因子 = 1–（3 × 加药孔 luc 值的 SD– 3 × 空白对照孔 luc 值的 SD）/（加药孔 luc 平均值–空白对照孔 luc 平均值）。

Z'因子值的范围在 0 ~ 1 之间，对细胞水平的筛选模型，当 Z'> 0.4 被认为该方法较稳定，适用于高通量药物筛选。

1.2.6 Real time-PCR 分析活性化合物黑麦酮酸D 对 GRα 靶基因的诱导效应 用 LO2细胞铺 6 孔板，在细胞密度达到 95% 后，用终浓度 0.015 mmol/L 的黑麦酮酸 D 处理。24 h 后 Trizol 法提取细胞总 RNA，反转录成 cDNA，以此为模板进行real time-PCR。

以 GAPDH 基因为内参，检测黑麦酮酸D 对 GRα 靶基因凝血因子II（coagulation factor II receptor precusor，F2R）、神经肽 Y 受体 Y2（neuropeptide Y receptor Y2，NPY2R）、UL16 结合蛋白 3（UL16 binding protein 3，ULBP3）、嗅觉受体OR8D4（olfactory receptor，family 8，subfamily D，member 4）的调节作用。

用 Primer Premier 5.0 软件设计引物，所有基因的引物见表 1。Real time-PCR 反应条件：①预变性：95 ℃，30 s；②两步法 PCR，变性：95 ℃，5 s；退火延伸：60 ℃，34 s；40 个循环。

2 结果

2.1 GRα LBD 片段和全长基因序列的克隆

用 Superscript 反转录试剂盒对人脑海马回总 RNA 进行反转录，再以cDNA 为模板进行 GRα LBD 基因和 GRα 全长基因的 PCR 扩增，所得 GRα LBD 片段经核酸电泳分析，其大小约 750 bp（图 1），GRα 全长基因的片段大小约 2300 bp（图 2），与预期结果大小相符。

表 1 Real time-PCR 所涉及的基因及其引物序列

bp 1 2 2000 1000750500250100

Figure 1 PCR product of GRα LBD fragment

2.2 表达载体 pBIND-GRα LBD、pTARGET-GRα 的构建

将 GRα LBD 和 GRα 全长基因的 PCR 产物进行胶回收，分别与 pGEM-T easy 载体进行连接构建成 pGEM-T-GRα LBD、pGEM-T-GRα 克隆载体。用I、HI酶对两种载体进行双酶切验证，将阳性克隆载体进行测序。测序的结果与 Genebank 报道的序列进行比较，结果一致。将 pGEM-T-GRα LBD、pGEM-T-GRα 经I、HI双酶切，切下的 GRα LBD 和 GRα 全长基因片段分别与 pBIND promoter 载体和 pTARGET载体连接，构建表达载体。进行双酶切鉴定，结果证明表达质粒pBIND-GRα-LBD、pTARGET-GRα 构建成功（图 3 和图 4）。

2.3 模型的验证

本研究利用 96 孔板进行转染实验，将表达质粒和报告质粒以 3:1 的比例进行共转染，以地塞米松为阳性对照，DMSO 为阴性对照对模型进行验证。结果如图 5 所示，GRα激动剂地塞米松可剂量依赖地诱导两个模型的荧光素酶的表达，对pBIND-GAL4-GRα LBD/p5 × UAS-luc 模型荧光素酶的最大上调倍数为 9.0 倍，EC50为0.28 mmol/L，Z'因子为 0.52；对 pTARGET-GRα/GRE 模型荧光素酶的最大上调倍数为 3.2 倍，EC50为1.81 mmol/L，Z'因子为 0.49。说明两个细胞筛选模型均具有较高的灵敏度和稳定性。

bp 1 2 45003000225015001000750500250

Figure 2 PCR product of GRα

bp 1 2 3bp 2313094166557436123322027 564 2000 1000750500250100

Figure 3 Restriction enzymatic analysis of recombinant vector pBIND-GRα-LBD

bp 1 2 23130941665574361 23322027 564

Figure 4 Restriction enzymatic analysis of recombinant vector pTARGET-GRα

诱导倍数Fold induction10 8 6 4 2 0 诱导倍数Fold induction3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.001 0.01 0.1 1 10 100 0.001 0.01 0.1 1 10 100 地塞米松浓度（μg/μl）Concentration of dexamethasone (μg/μl)A 地塞米松浓度（μg/μl）Concentration of dexamethasone (μg/μl)B

Figure 5 Effects of agonist dexamethasone on transactivities of GRα (A: 5 × UAS-luc; B: 4 × GRE-luc)

2.4 模型筛选

利用建立的筛选模型，对华北制药集团的 2000 多个来源于微生物、植物以及化学合成的单体化合物进行了初筛和复筛工作，获得多个活性化合物，其中从微生物来源的天然产物中筛选得到化合物黑麦酮酸D（图 6），该化合物对5 × UAS-luc 和 4 × GRE-luc 两个模型的报告基因具有较好的转录激动活性（图 7）。其最大激活倍数分别为 2.6 倍和 3.2 倍，EC50分别为 0.27 和 0.68 mmol/L。

图 6 黑麦酮酸D 的化学结构式

Figure 6 The chemical structure of secalonic acid D

2.5 Real time-PCR 分析黑麦酮酸D 对 GRα 靶基因的诱导效应

为了进一步验证黑麦酮酸D 对 GRα 的激动活性，本研究利用 real time-PCR 方法对黑麦酮酸D 对 GRα 的靶基因 F2R、NPY2R、ULBP3、OR8D4 在 mRNA 转录水平的变化进行了分析研究。结果如图 8 所示，经过黑麦酮酸 D 处理的细胞中，GRα、F2R、NPY2R、ULBP3、OR8D4 mRNA 水平的表达量均明显上调，上调倍数分别为处理前的 1.56、2.55、2.11、2.31、2.27 倍，该结果进一步证明了黑麦酮酸 D 对 GRα的激动效应。

诱导倍数Fold induction3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 诱导倍数Fold induction3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.01 0.1 1 10 0.01 0.1 1 10 黑麦酮酸 D 浓度（μg/μl）Concentration of secalonic acid D (μg/μl)A 黑麦酮酸 D 浓度（μg/μl）Concentration of secalonic acid D (μg/μl)B

Figure 7 Effects of secalonic acid D on transactivities of GRα (A: 5 × UAS-luc; B: 4 × GRE-luc)

mRNA 诱导倍数Fold induction of mRNA level3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 GAPDH GRα F2R NPY2R ULBP3 OR8D4 基因Genes

Figure 8 The mRNA levels of GRα, F2R, NPY2R, ULBP3, OR8D4 in LO2cells treated with secalonic acid D

3 讨论

本研究建立了两种核受体配体活性研究方法：一是哺乳动物单杂交技术，即将核受体的配体结合域（LBD）与酵母转录因子 GAL4 的 DNA 结合域（DBD）融合成嵌合表达质粒，再与含 GAL4 特异响应元件 UAS 的报告质粒共转染到哺乳动物细胞中，通过测定下游报告基因表达量来评价配体的调节功能；二是利用 GRα 的响应元件 GRE，与表达质粒共转染，检验化合物对 GRα 的转录激动活性，这两种方法在体外活性测定中可以相互印证。两个有关糖皮质激素受体调节剂筛选模型具有一定的创新性，利用地塞米松作为阳性药，很好地测试了两个模型的灵敏性和可靠性，另通过筛选获得一个微生物产物为阳性样品，并通过考察其相关靶基因的表达，确认了阳性化合物的相关活性。

地塞米松是一种人工合成的糖皮质激素，是一个已知的 GRα激动剂，临床用来治疗多种炎症，如类风湿关节炎、牙周炎、足底筋膜炎，也被用来与抗生素合用治疗细菌性脑膜炎和鼻炎等。作为阳性对照药，地塞米松在本研究建立的两个模型上具有很好的活性以及良好的剂量依赖关系，证明了该模型具有高的信躁比、灵敏度和稳定性，可以用于 GRα激动剂的筛选。

黑麦酮酸 D 是一个微生物来源的天然产物，已被报道具有抗真菌和抗肿瘤活性[11]。本研究首次发现黑麦酮酸D 对 GRα 的转录调控作用具有激动活性。F2R、NPY2R、ULBP3、OR8D4被报道是 GRα 的靶基因[12]。F2R、OR8D4 基因与激素代谢，应激响应有关；NPY2R 参与机械性疼痛，对创伤愈合，糖尿病的发生发展有影响[13]；许多恶性肿瘤细胞表面表达 ULBP3，人类相关肿瘤如慢性 B 型淋巴细胞白血病、胃肠道肿瘤等的研究均与 ULBP3 有重要关系[14-15]。本研究的定量 PCR 结果证实黑麦酮酸 D 对 GRα 的这几个靶基因在 mRNA 水平上具有明显的诱导效应，这不仅进一步证明黑麦酮酸 D 是 GRα 的激动剂，而且说明了该化合物可能通过 GRα 的激活，在多种生理功能方面具有调控作用。下一步我们将利用建立的模型继续进行活性化合物的筛选，并对已筛选到的活性化合物进行深入的抗炎及其他药效的研究。

[1] Pujols L, Mullol J, Torrego A, et al. Glucocorticoid receptors in human airway. Allergy, 2004, 59(10):1042-1052.

[2] Evans RM. The steroid and thyroid hormone receptor superfamily. Science, 1988, 240(4854):889-895.

[3] Smoak KA, Cidlowski JA. Mechanisms of glucocorticoid receptor signaling during inflammation. Mech Ageing Dev, 2004, 125(10-11): 697-706.

[4] Newton R. Molecular mechanisms of glucocorticoid action: what is important? Thorax, 2000, 55(7):603-613.

[5] Elenkov IJ. Glucocorticoids and Th1/ Th2 balance. Ann N Y Acad Sci, 2004, 1024:138-146.

[6] Yan TZ, Zhang XS, Li QZ. Relation of AR and GR expressions to biological behavior of prostate cancer. J Med Forum, 2008, 29(5):13- 15. (in Chinese)

闫天中, 张祥生, 李启忠. AR GR表达与前列腺癌生物学行为的关系. 医学论坛杂志, 2008, 29(5):13-15.

[7] Li W, Yu MX, Wang GF, et al. The level of glucocorticoid receptor on peripheral blood monocytes of patients with Rheumatoid arthritis. Beijing Med J, 2008, 30(4):208-211. (in Chinese)

李薇, 于孟学, 王国锋, 等. 糖皮质激素受体在类风湿关节炎外周血单个核细胞中表达水平的研究. 北京医学, 2008, 30(4):208-211.

[8] Feldman S, Weidenfeld J. Electrical stimulation of the dorsalhippocampus caused a long lasting inhibition of ACTH and adrenocortical responses to photic stimuli in freelymoving rats. Brain Res, 2001, 911(1):22-26.

[9] Liu JF, Xu AE, Song FJ. Study on the relationship between the expressions of glucocorticoid receptor α and β mRNA in peripheral blood mononuclear cell of patients with polymyositis/dermatomyositis and the glucocorticoid efficacy. Chin J Immunol, 2007, 23(4):364-367. (in Chinese)

刘继峰, 许爱娥, 宋芳吉. 多发性肌炎/皮肌炎患者外周血单个核细胞中糖皮质激素受体 α、β mRNA表达与糖皮质激素疗效相关性的研究. 中国免疫学杂志, 2007, 23(4):364-367.

[10] Zheng ZH, Lv GP, Si SY, et al. A cell-based high-throughput screening model for farnesoid X receptor agonists. Biomed Environ

Sci, 2007, 20(6):465-469.

[11] Steyn PS. The isolation, structure and absolute configutation of secalonic acid D, the toxic metabolic of Penicillium oxalicum. Tetrahedron, 1970, 26(1):51-57.

[12] Zeng L, Gu W, Yan J, et al. Bioinformatics analysis of human glucocorticoid receptor regulated target genes. Basic Clin Med, 2005, 28(11):1146-1150. (in Chinese)

曾灵, 顾玮, 严军, 等. 人糖皮质激素受体调控靶基因的生物信息学分析. 基础医学与临床, 2005, 28(11):1146-1150.

[13] Brumovsky P, Stanic D, Shuster S, et al. Neuropeptide Y2 receptor protein is present in peptidergic and nonpeptidergic primary sensory neurons of the mouse. J Comp Neurol, 2005, 489(3):328-348.

[14] Long EO, Rajagopalan S. Stress signals activate natural killer cells.J Exp Med, 2002, 196(11):1399-1402.

[15] Song H, Kim J, Cosman D, et al. Soluble ULBP suppresses natural killer cell activity via down-regulating NKG2D expression. Cell Immunol, 2006, 239(1):22-30.

Establishment and application of high throughput drug screening models for glucocorticoid receptor α modulators

SUN Cai-xia, ZHANG Zhen-liang, ZHENG Hai-zhou, LU Xin-hua, ZHENG Zhi-hui, ZHAO Bao-hua, DUAN Bao-ling

To develop high throughput screening models for glucocorticoid receptor α (GRα) modulators and discover novel modulators of GRα.

The ligand binding domain (LBD) fragment and full-length gene of GRα were amplified by real time-PCR from human hippocampal total mRNA to construct chimera expression plasmid pBIND-GAL4-GRα LBD and full length express plasmid pTARGET-GRα. The screening models were developed by transfecting the HeLa cells, and the efficiency of modulators on the transactivities of GRα was assayed by measuring the reporter luciferase gene expression. The mRNA levels of targeting genes of GRα in cells were analyzed by real time-PCR.

Dexamethasone, a known GRα agonist, could induce the expression of luciferase in a dose-dependent manner in the both screening models. For the 5 × UAS-luc model, the maximum fold of induction was about (9.0 ± 0.2), the EC50value was about (0.28 ± 0.07) mmol/L, and the parameter Z'-factor value was about 0.52. In the 4 × GRE-luc model, the maximum fold of induction was about (3.2 ± 0.3), the EC50was (1.81 ± 0.13) mmol/L, and the parameter Z'-factor value was 0.49. After screening, one microbial metabolite secalonic acid D from 2000 compounds was identified as a GRα agonist, it could significantly induce the luciferase expression, and the maximum induction folds was about 2 - 3 on both assays. The further real time-PCR results showed that secalonic acid D could increase the mRNA levels of GRα target genes F2R, NPY2R, ULBP3 and OR8D4 in the treated cell line LO2.

The two screening models are robust and sensitive, and can be used to discover the GRα new modulator. Secalonic acid D has been discovered as a new GRα agonist.

Glucocorticoid receptor α; Biological response modifiers; Hypoglycemic agents; High throughout screening

ZHENG Zhi-hui, Email: anzhengzhihui@hotmail.com; ZHAO Bao-hua, Email: zhaobaohua@mail. hebtu.edu.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.02.005

国家自然科学基金（81173137）；“重大新药创制”国家科技重大专项（2012ZX09301002-003）；河北省科技支撑计划重点项目（13272607D）

郑智慧，Email：anzhengzhihui@hotmail.com；赵宝华，Email：zhaobaohua@mail.hebtu.edu.cn

2013-12-11

Author Affiliations: College of Life Science, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050016, China (SUN Cai-xia, ZHANG Zhen-liang, ZHENG Zhi-hui, ZHAO Bao-hua); New Drug Research & Development Center of North China Pharmaceutical Group Corporation, Shijiazhuang 050015, China (ZHENG Hai-zhou, LU Xin-hua, ZHENG Zhi-hui, DUAN Bao-ling)